【实验题目】
脂类细胞化学--苏丹III染色法
【实验目的】
1. 了解脂肪染色的原理、掌握脂类标本制片；
2. 学习用苏丹III染色法进行脂肪细胞的染色技术；
3. 学会用断头法处理小白鼠以及小白鼠的解剖方法。
【实验材料与用品】
1. 试剂：苏丹Ⅲ染液、70%乙醇溶液、甲醛钙
2. 器具：显微镜，载玻片，盖玻片，胶头滴管，镊子，剪刀，解剖盘
3. 材料：小白鼠
【实验原理】
脂类包括的范围很广，有单纯脂、复合脂、衍生脂等。脂肪依其性质可分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂以及其他类脂质。脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质。很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。
脂肪与类脂类和蛋白质结合时，往往不易显出，但用重铬酸钾、升汞、硝酸钴或硝酸铀氧化组织块或切片，可以显现出脂肪和类脂类。
脂类不溶于水，易溶于浓乙醇、苯、氯仿和乙醚等，因此脂类标本的制作，需用不含酒精或不能溶脂的液体固定，一般常用甲醛类固定剂。
脂溶性染料显示法利用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV、苏丹黑或者苏丹红等溶于脂类，而使脂类显色的原理显示脂类，使用时，要注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。 苏丹染料是偶氮染料，它对脂类的显示是一种简单的物理变化。 苏丹染料也是一种脂溶性染料，易溶于乙醇但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，苏丹染料即脱离乙醇而溶于该含脂肪结构中而使其显色。
脂肪染料一般选用有机溶剂做溶剂，丙酮和乙醇对染料和脂肪都是很好的溶剂，这样可以染色大的脂肪积累块，但是小的脂肪滴会溶解。60%异丙醇当溶剂，可以减轻脂类的溶解。丙二醇或磷酸三乙酯不会溶解脂类物质，但是能溶解染料，是比较理想的溶剂。用这些溶剂配的染料溶液要过滤以去掉沉淀，防止蒸发，因蒸发会引起染料在材料中积累。常用相同溶剂洗掉多余的染料，然后再用水洗，可以防止多余的染料在材料中沉淀。
用锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等类似的液体，可用于石蜡切片，但是脂肪的标本一般不用石蜡切片或火棉胶包埋，而用如下方法： 冰冻切片、明胶包埋冰冻切片、铺片法。
【实验步骤】
一、大体流程
二、具体操作
1、 断头法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，用镊子提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜，
并在其下部置一载玻片，用剪刀将肠系膜连同小肠一同剪下。
2、 滴加甲醛钙于有标本的载玻片处，使标本润湿，固定20分钟。
3、 吸蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗，用滴管不断吸去液体以去除固定液。
4、 用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作，再进行一次冲洗。
5、 用苏丹Ⅲ染色30分钟。
6、吸去溢出染液，擦净盖玻片表面及周边，用显微镜观察。
【实验结果与分析】
I. 单个脂肪细胞是圆球形，内充满桔红（黄）色脂类物质。
图1: 10×10
II. 观察到的细胞染色较浅，可能是滴加染液时进入到盖玻片以下的苏丹III染液的量偏少，或者是用蒸馏水冲洗后没有用酒精冲洗干净，不利于染色。此外，观察到的细胞有些不是一层，而是多层细胞重叠在一起，可能是取肠系膜时，没有将肠系膜展平，导致肠系膜聚集在一起。
图2: 10×40
III. 细胞核呈指环状偏靠细胞膜边缘，细胞外也有散在的脂肪滴。但大部分细胞内的脂肪滴
已完全充满整个细胞，可能是观察的时间拖得过长。单个细胞的染色效果不明显，可能是染色时间不足。
图3： 10×40
【注意事项】
1.小鼠肠系膜很脆弱，易破损，因此找肠系膜时应尽量小心，以免将肠系膜扯破；
2.要找有血管的肠系膜，因为血管周围一般有脂肪组织保护；
3.制作装片时尽量用盖玻片撑开肠系膜，可以将小肠连同肠系膜一起剪下来；
4.不要用力按压盖玻片，以免压破脂肪细胞，影响观察；
5.染色时间要足够长，否则会染色不彻底，橘红色不明显；
6.在染色过程中，要防止装片干燥，随时添加苏丹III染液，防止影响实验结果；
7.在进行观察之前，应当用吸水纸尽可能地吸取染液后再进行观察，这样只有脂肪细胞呈橘
红色，对比较明显。
附：课外拓展知识
一、石蜡切片制备
石蜡切片的制作过程主要包括：取材 固定 脱水 透明 透蜡 ,
封藏 透明 染色 贴片 切片 包埋
1．取材
材料的好坏直接影响到切片的质量,无论取哪一种动植物材料,以下几点是必须注意的.
（1）植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分；动物材料取用时常对动物施以
麻醉,常用的麻醉剂有氯仿和乙醚,或将动物杀死后迅速取出所需要的组织.
（2）取材必须新鲜,这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要,应该尽可能割取生活着的组织
块,并随即投入固定液.
（3）切取材料时刀要锐利,避免因挤压细胞使其受到损伤.
（4）切取的材料应该小而薄,便于固定剂迅速渗入内部.一般厚度不超过2mm,大小不超过
5×5mm2.
2．固定
组织和细胞离开机体后,在一定时间内仍然延续着生命活动,会引起病理变化直至归于死亡.为了使标本能反映它生前的正常状态,必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞,阻抑上述变化,并将结构成分转化为不溶性物质,防止某些结构的溶化和消失.这种处理就是固定.除了上述作用外,固定剂会使组织适当硬化以便于随后的处理,还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色.
固定剂的作用对象主要是蛋白质,至于其他成分如脂肪和糖,在一般制作时不加考虑,如要观察这些物质,可用特殊的方法将其固定下来。固定剂有简单固定剂和混合固定剂的划分。
简单固定剂即单一的固定剂,常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸.其中,苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白,又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白,而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。
简单固定剂的局限性较大,如将其适当混合,制成复合固定剂可以取得更好的效果。
常用的混合固定剂有：Bouin液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重铬酸钾2.5g＋硫酸钠1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸镏水）、Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）等.固定剂的种类甚多,我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。
固定时,须注意以下几点：
（1）固定剂应有足够的量,一般为组织块体积的10～15倍.
（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质,可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟,再移
入水溶性的固定液.
（3）材料固定后如不立即下沉,可将其中气泡抽出.
（4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异,可从1小时到几十小时,有时中间需要更新固定
剂.某些固定剂对组织的硬化作用较强,作用时间应严加控制,不能过长.
（5）一般固定剂都以新配制的为好,用过的不能再用.有些混合固定剂由甲、乙两液合并者,
一定要在使用前才混合.
（6）固定完毕,根据所用固定剂的不同,用水或乙醇冲掉残留的固定剂,以免固定剂形成沉淀,
影响以后组织块的染色.
3．脱水
.脱水剂有两类：一类是非石蜡溶剂,如乙醇、丙酮等,脱水后必须再经过透明,才能透蜡包埋；
另一类是兼石蜡溶剂,如正丁醇,脱水后即可直接透蜡。
常用的脱水剂是乙醇,因为它价格便宜,易于得到。为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩,脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行,一般组织从30％乙醇开始,经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水；对于一些柔软的组织应从15％开始.脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中,因为低浓度乙醇易使组织变软、解体,高浓度乙醇有脆化组织作用,放置时间不能过长,另外,脱水必须在有盖瓶中进行,以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底.需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中,如需长期保存,可加入等量的甘油. 4．透明
组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明.透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合,它取代了脱水剂后,石蜡便能顺利地渗入组织。
透明剂的种类很多,较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。
5．透蜡和包埋
包埋用的石蜡,熔点在50～60℃之间,应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用.一般动物材料最常用的石蜡熔点为52～56℃,植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的,切片厚的则用52～54℃的；室温10～19℃时选用52～54℃的石蜡可顺利切片,冬季可用熔点46～48℃的石蜡,夏季可选56～58℃的.
透蜡须在恒温箱中进行,恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度,使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理.纯石蜡应处理2～3次,透蜡的时间依材料性质而定,一般每次需15～30min。
包埋具体做法；先准备好纸盒，,将熔蜡倒入盒内,迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部,切面朝下,再轻轻提起纸盒,平放在冷水中,待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中,使其迅速冷却凝固,30min后取出。
包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度,保证组织块与周围石蜡完全融为一体.石蜡的迅速冷却也很重要,否则包埋块中将会产生结晶.以后切片时引起碎裂。
6．切片
在包埋以后,就可进行切片.包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修.
切片方法：
切片前,将刀口置放大镜下观察,选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削.将所要切的包埋块固定在标本台上,使包埋块外切面与标本夹截面平行,并让包埋块稍露出一截.将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋,上好刀片,使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角,包埋块上下边与刀口平行.在微动装置上调节切片要求的厚度,将刀台移至近标本台处,让刀口与组织切面稍稍接触,这时就可以开始切片了。具体操作：右手转动转轮,左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子,并托住切下的蜡带,待蜡带形成一定长度后,右手停止转动,持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起,平放于衬有黑纸的纸盒内,注意切片速度不宜太快,摇动转轮用力应均匀,防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀,还应注意转动的方向,以防标本台后移而切不到片子.切片完毕,应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。
7．贴片
切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理,但是切片常有细小的横纹,必须经展平后才能贴附,否则影响染色和观察.贴片一般有捞片法和烫板法.
捞片法：首先将切片分割开,投入到48℃的温水浴中,这时切片都浮在水面上,由于表面张力的作用使切片自然展平,然后用涂有甘油蛋白溶液（将鸡蛋一个打破入杯中,去除蛋黄留下蛋白,用筷子充分调打成雪花状泡沫,然后用双层纱布过滤至容器中,加入等量的甘油,混合,最后加入百分之一体积的麝香草酚（thymol）作防腐用,可保存几个月到一年.）或5％明胶水溶液的载玻片倾斜着插入水面去捞取切片,使切片贴附在载玻片的合适位置,于室温下放置一昼夜后使其彻底干燥。
烫板法：是将涂有粘片剂的载玻片上涂上水,把已分割好的切片贴上去,再置载玻片于35℃恒定的烫板上让切片摊干,并倾斜或用吸水纸吸去水分,最后将载玻片再度放烫板上晾干.
要注意,不管是使用捞片法还是烫板法,所用的载玻片必须洁净,不能有油污（检验法：已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸馏水,若发现水不均匀分散而聚成滴状,即表示载玻片不清洁,有残留油脂等物在上面）；切片的光面应朝下,否则染色过程中切片容易脱落。
8．染色
染色方法很多,但是染色剂往往是水溶液,因此切片必须经过脱蜡而再度复水.这方法即为脱水、透明的逆过程。由于切片十分薄,处理的时间大大减少,一般每级停留约2～5min。
染色是一个复杂的过程,研究细胞器和细胞内的重要组分都有很多现成的方法，例如显示DNA的Feulgen反应,显示RNA的Brachet反应,显示多糖的PAS反应,显示蛋白质的Millon反应和显示某些酶的钙—钴法等,可以根据不同的要求来选用。
9．透明
染色后的切片须再次经过脱水、透明.标本经二甲苯透明后,折射率改变,透明度提高,使得染上色的部位更清晰地显示出来。
10．封藏
封藏的目的是使制成的切片能够永久保存,封藏剂必须能与透明剂互溶,对染色无影响,折射率近似玻璃和具有粘性的物质,常用的封藏剂有加拿大树胶和中性树胶。
封片方法：将载玻片从二甲苯中吸出后,吸去多余的二甲苯,在标本上的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶,仔细覆盖上盖玻片,避免产生气泡,也不得拖动盖玻片,以免将标本破坏.树胶量视盖玻片大小而定,勿使过多过少。贴上标签,注明材料、染色法,待封藏剂凝固后便成为一张石蜡切片.
二、糖类细胞化学
Ø PAS法显示糖类
原理：过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛，再与Schiff氏液的无色品红结合，
红色，定位于胞浆上。
结果：PAS阳性为红色，细胞核蓝色。
三、核酸细胞化学
Ø Feulgen反应法
原理：标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。
Ø 甲基绿-派洛宁法
原理：甲基绿—派洛宁（methyl green-pyronin）为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色（但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色）。即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成绿色。
Ø Giemsa染色法
原理：Giemsa染液由天青，伊红组成，染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。
嗜酸性颗粒碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果染成粉红色，称为嗜酸性物质；
细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合染成紫蓝色，称为
嗜碱性物质；
中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。
结果：MGG染色将细胞核染成紫红色，细胞质和核仁染成蓝紫色。
Ø 苏木精-伊红（HE)染色
原理：DNA两条链上的磷酸基向外，带负电荷呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性
染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝
色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。
结果：细胞核呈蓝色，细胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。钙盐和细菌
可呈蓝色或紫蓝色。
四、蛋白质细胞化学
Ø 碱性蛋白与酸性蛋白显示
以酸性氨基酸成分为主的蛋白质为酸性蛋白；以碱性氨基酸为主的蛋白质为碱性蛋白。细胞核内有组蛋白（碱性蛋白）及少量酸性蛋白，细胞质中主要有酸性蛋白，标本经三氯醋酸处理抽提掉核酸后，用不同PH值的快绿染液分别染色，使细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。
Ø 酸性磷酸酶显示
当酸性磷酸酶与含有磷酸酶的作用底物一起保温时，能水解磷酸酯使其释放出磷酸基，磷酸基仅为与底物中存在的铅盐结合形成无色的磷酸铅沉淀物，当用黄色的硫化铵作用该沉淀时可形成黄棕色或棕黑色的硫化铅沉淀；进而使细胞中酸性磷酸酶显示出来。
Ø 过氧化物酶显示
细胞内的过氧化氢酶可以催化过氧化氢氧化联苯胺成蓝色或棕色产物，蓝色为中间产物联苯胺蓝，很不稳定，可自然转变为棕色的联苯胺腙，通过产物颜色间接显示出细胞内过氧化物酶的分布。
Ø 测定琥珀酸脱氢酶显示
琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种：
① 硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法
② 铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法
③ TTC（氯化三苯四氮唑）法
④ MTT法
⑤ NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法