SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

CHANG X C

[实验目的]

（1）掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。

[实验原理]

电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。

电泳过程必须在一种支持介质中进行。最初的支持介质是滤纸、醋酸纤维素膜和硅胶，这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）分为“连续系统”和“不连续系统”两种电泳系统，在本实验中选用不连续系统。“不连续系统”最大的优点在于大大提高了样品分离的分辨率。这种电泳的主要特点是：①使用两种不同浓度的凝胶系统；②配制两种凝胶的缓冲溶液成分及pH不同，并且与电泳槽中电泳缓冲液的成分、pH也不相同。在本实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶或成层胶，配制此层胶的缓冲液是Tris-HCl，pH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶或电泳胶，成胶的缓冲液是Tris-HCl，pH8.9；电泳槽中的电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，pH8.3。可见，凝胶浓度、成胶成分、pH与电泳缓冲系统各不相同，形成了一个不连续系统。

电泳时，蛋白质样品放置在浓缩胶上，为防止蛋白质样品在电极缓冲液中扩散，因而加入等体积的40%蔗糖或50%甘油与之混合，以提高密度。为观察蛋白质样品泳动的情况，样品中还加入溴酚蓝等示踪染料，这些有色物质的分子比任何一种大分子物质泳动的速度都快，只要染料未泳动出凝胶，样品就没有走出凝胶的危险。

在不连续系统中，当接通电源开始电泳时，系统中的甘氨酸、蛋白质、盐酸中的氯离子和溴酚蓝等均解离为阴离子，形成离子流向阳极泳动，其迁移率取决于离子的电荷数、分子量大小及形状。然而，当电极缓冲液（pH8.3）中的甘氨酸离子在进入浓缩胶时，它们遇到了比pH8.3低的pH(6.7)，pH下降了近两个单位，几乎接近于甘氨酸的等电点（5.97），于是甘氨酸的解离度突然降低，所带电荷量明显减少，迁移率减慢；样品中各蛋白质成分也进入浓缩胶，pH值的改变虽对其解离度有影响，但比对甘氨酸要小得多，其迁移率比甘氨酸

-要大，而且浓缩胶的胶孔较大，对蛋白质分子不会造成阻碍；浓缩胶中的Tris-HCl中的Cl

则全部解离，相对分子质量很小，摩擦力不大，其迁移率比蛋白质、溴酚蓝都快；于是在浓

-缩胶中各种离子的迁移率形成：甘氨酸<蛋白质<溴酚蓝<Cl的顺序。

甘氨酸分子进入浓缩胶后解离度的下降，造成移动离子流的突然缺失，出现电流减小、电导率下降。然而，整个电泳系统中其他部分的电流仍维持不变，根据电导与电位梯度成反

-比（E=I/n，E为电位梯度，I为电流强度，n为电导率）的关系，于是在前导离子Cl离子

与慢离子甘氨酸离子之间突然形成了较高的局部电位梯度。处在这个局部高电位梯度区域中的样品中各蛋白质成分，在高电场作用下迅速以不同的速度（因相对分子质量不同、带电量

--不同）泳向前导Cl区域。当到达前导Cl区域时因不缺少离子，大的电场强度减弱，离子移

-动速度急速减慢下来，其结果是在甘氨酸和Cl之间的蛋白质样品就按其分子的大小堆积或

浓缩成层。通过上述过程，使蛋白质样品浓缩了好几百倍，且样品中各蛋白质成分也按一定的顺序排列成层。

当离子流继续向前，进入以pH8.9缓冲液配制的小孔胶时，蛋白质分子在小孔胶里遇到阻力，迁移率减慢；同时在pH8.9条件下，甘氨酸又充分解离，其带电量增加，消除了离子流缺失的现象，小分子的甘氨酸离子赶上并超过样品中各蛋白质成分；凝胶各部分恢复恒定的电场强度。因此，分离胶中的各蛋白质成分由于所带净电荷及相对分子质量不同，故在均一的电场强度和pH条件下，经分离胶电泳后而被分离。

由以上的原理可见，聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳最主要的优点就是使蛋白质样品经浓缩胶后，形成紧密地压缩层进入分离胶。蛋白质各成分预先分开且压缩成层，可以减少在电泳时，成分间由于自由扩散而造成的区带相互重叠所带来的干扰，这样就提高了电泳的分辨能力。由于这个优点，少量的蛋白质样品（1～100?g）也能分离得很好。

十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，由于SDS分子本身带有负电荷，能够与蛋白质的疏水区相结合，使蛋白质伸展和解聚，从而使蛋白质呈一致的强负电荷。当采用加有SDS的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳时，利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应，可以进行蛋白质分子量的测定。

在用该方法进行分子量的测定中，利用某些已知分子量的指示蛋白与经SDS处理后解离成肽链的蛋白质样品进行电泳比较，根据蛋白质的电泳迁移率，在一定的分子量范围内与分子量的对数所呈的线性关系，就可以测定出肽链的分子量。当同时有还原剂存在时，多肽链内部的二硫键则被断开，形成巯基。因此用该方法测得的是蛋白质亚基的分子量。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可以采用园盘电泳的形式，也可以采用垂直板状电泳的形式，其操作步骤大致相同。另外，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳亦分为连续体系和不连续体系。本实验采用垂直板状不连续系统的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，了解和掌握利用该方法测定分子量的技术。

SDS-PAGE可以用于蛋白质的分离、分子量测定和纯度鉴定。制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度,对于不同分子量样品建议使用的凝胶浓度：

分 子 量 胶 浓 度（%）

4 ＜10 20-30

4 1-4×10 15-20

45 4×10-1×10 10-15

55 1×10-5×10 5-10

5 ＞5×10 2-5

检测蛋白质最常用的染色剂是考马斯亮蓝R－250（CBB，Coomassie brilliant blue），通常是用甲醇：水：冰醋酸（体积比为45：45：10）配制0.1％或0.25％（W/V）的考马斯亮蓝溶液作为染色液。这种酸－甲醇溶液使蛋白质变性，固定在凝胶中，防止蛋白质在染色过程中在凝胶内扩散，通常染色需2小时。脱色液是同样的酸－甲醇混合物，但不含染色剂，脱色通常需过夜摇晃进行。

[试剂与器材]

1、30％(W/V)丙稀酰胺（Acr）30g、双丙烯酰胺（Bis）0.8g，100mL无离子水溶解，过滤，于4℃暗处储存，1个月内可使用。

2、1mol/L pH8.8 Tris-HCL缓冲液：Tris24.2g加入无离子水中使之溶解，再加入1mol/L HCL溶液调pH

至8.8，最后加无离子水定容至200ml。

3、1mol/L pH6.8 Tris-HCL缓冲液：Tris12.1g加入无离子水中使之溶解，再加入1mol/L HCL溶液调pH

至6.8，最后加无离子水定容至100ml。

4、电极缓冲液(pH=8.3)： Tris30.3g、甘氨酸144.2g、SDS 10g，溶于无离子水并定容至1000ml，使用时

10倍稀释。

5、2×样品稀释液：3ml甘油、l ml巯基乙醇、500mgSDS、4mg溴酚蓝、2mL 1mol/L pH6.8 Tris-HCL缓冲

液，无离子水定容至10ml,-20℃贮存。以此液制备样品时，样品若为固体应稀释1倍使用；样品若为液体，则加入与样品等体积的原液混合即可。

6、10％（W/V）过硫酸铵（AP）溶液：l gAP溶于10ml 无离子水中（要求现用现配）。 7、四甲基乙二铵（TEMED）

8、染色液：1.0g考马斯亮兰R-250，甲醇450ml，冰醋酸100ml加入50ml水中溶解后过滤使用。

9、脱染液：70mL冰醋酸、200mL甲醇、1730mL水，混匀使用。使用后的脱色液用活性炭吸附后过滤，可

以重复使用。 10、10%(W/V) SDS

11、标准蛋白（低分子量蛋白Marker） 12、蛋白样品：由实验室给定。 13、垂直平板电泳槽 14、电泳仪

15、微量进样器等。

[实验步骤]

l、安装垂直板电泳槽：按照仪器说明书的要求将垂直板电泳槽安装好，并在将准备灌胶的

两块玻璃板的间隙灌满蒸馏水，通过检查是否漏水来检验密封性是否好。如果漏水，需要重新安装；如果不漏水，说明密封性好，可以用以灌胶。将电泳槽玻璃板洗净，吹干，安装好； 2、用硅橡胶条封严玻璃板的边和底（保证不漏胶）；

3、制胶

（1）配分离胶：

从冰箱取出制胶试剂，应平衡至室温。

凝胶浓度

30％丙烯酰胺（mL）

1mol/L pH8.8 Tris-HCI缓冲液（mL）

无离子水（mL） 10％ SDS（mL） 10% AP（mL） TEMED(μL)

5% 5.0 11.2 13.7

7.5% 7.5 11.2 11.2

10% 10 11.2 8.7 0.3 0.1-0.2 20

12.5% 12.5 11.2 6.2

15% 15 11.2 3.7

混匀后，将配好的分离胶立即倒入两块玻璃板的间隙中，至胶液面离玻璃板凹槽3.5cm左右，然后在胶面上轻轻铺上1cm高的水，加水时要慢，勿扰乱胶面。室温20－30min左右聚合。可见凝胶与水之间有一清晰界面。倾去水封层的蒸馏水，再用没有毛边的滤纸条吸去多余水分 （1） 配浓缩胶

凝胶浓度

30％丙烯酰胺（mL）

1mol/L pH6.8 Tris-HCL缓冲液（mL）

无离子水（mL） 10％ SDS（mL） 10% AP（mL） TEMED(μL)

加入体积 1.67 1.25 7.03 0.1 0.1 10.0

混合上述溶液，用少量灌入玻璃板间隙中，冲洗后弃去，再把余下的胶液注入间隙，使胶液面与玻璃板

凹槽处平齐，插入“梳子”，室温20－30min聚合。

4、待胶凝固后，拔出梳子，加入电极缓冲液（淹没胶，但不高于电泳槽）。

o

5、样品处理：取标准蛋白或样品10μL，加入10μL 2×样品稀释液，混匀，100C水浴加热3-5min；

6、进样：将处理好的样品15μl加入到凝胶孔中，连接电泳仪；

7、电泳：打开电源，调整电压至100V，电流20mA开始电泳，待样品全部进入凝胶后，将电压调至120V，电流25mA继续电泳，待指示剂（溴酚兰）到达凝胶的底部距离下缘1cm时停止电泳，取下玻璃板小心地把其中一块玻璃板从凝胶上取下来，取出分离胶（注意保持胶的完整性），在分离胶板一端切除一小角作为标记，并将其移至大培养皿中染色。

8、染色：将分离胶浸入染色液中染色30min左右；

9、脱染：取出分离胶，先用蒸馏水漂洗一次，用脱色液浸泡漂洗染过色的分离胶板数次，直至胶板背景蓝色褪去，并可见清晰的电泳图谱为止（若用褪色摇床，则可缩短褪色时间。脱色液经活性碳脱色后，可反复使用）。电泳图谱可以用凝胶成像系统拍照，凝胶可以在7%乙酸溶液中保存。

10、通过观察电泳图谱就可以检测到IgG的分离纯化效果及纯度。

[注意事项]

1、 由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻

璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂，为防止此现象，所用器材均应严格的清洗。硅橡胶条的凹槽、样品槽模板（“梳子”）及电泳槽用泡沫海绵醮取“洗洁精”仔细清洗。玻璃板浸泡在重镉酸钾洗液3－4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗净，再用泡沫海绵醮取“洗洁精”反复刷洗，最后用无离子水冲洗，直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。

2、 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶条时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，

以免缓冲液渗漏。样品槽模板梳齿应平整光滑。

3、 灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。

4、 凝胶完全聚合后，必须放置30min-1h，使其充分“老化”后，才能轻轻取出样品槽模板，

切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。

5、 为防止电泳后区带托尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品可用透析法或凝

胶过滤法脱盐。最大加样量不得超过10μg 0蛋白/100μL。

6、 电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反向泳动，电泳时应选用合

适的电流、电压，过高或过低均可影响电泳效果。

7、 电泳后，应分别收集上、下贮槽电极缓冲液，在冰箱贮存，可用2－3次。为保证电泳

结果满意，最好用新稀释的缓冲液。

8、 丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故溶液的pH值应不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。

第二篇：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量

实验七 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子

量

实验数据：

标准曲线：

y=5.05-1.10x

结果：

一. 实验目的和要求

1 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。

2 掌握垂直板电泳的操作方法。

3 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。

二 .实验原理

? 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。

? 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。

? 区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 ? SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个：

1) 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3

2) 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10～100mmol/L

3) 二硫键是否完全被还原

三. 实验试剂和器材

1.材料：

低分子量标准蛋白试剂盒:

低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400

牛血清白蛋白 MW=66,200

兔肌动蛋白 MW=43,000

牛碳酸酐酶 MW=31,000

胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100

鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400

开封后溶于200?l蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。

样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。

2.实验试剂

(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺

（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中，

4℃贮存可用1-2月。

（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）

（3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，

加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏

水定容至100ml。

（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加

入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水

定容至100ml。

（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加

入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定

容至100ml。

（7）10%过硫酸铵(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+

溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris-

HCl（2ml），最后定容至10ml。

（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。

（11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液

250ml， 过滤后备用。

（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。

（13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。

3. 实验器材

? 垂直板电泳装置

? 直流稳压电源

? 移液管

各部分凝胶配制

四. 实验过程

1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形瓶.

2.把玻璃板在灌胶支架上固定好.

※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.

3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置

40分钟.

※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.

※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡

※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.

4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟.

※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.

5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去 底端的琼脂糖.

※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.

6、加样三个。 （1）取10?l标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10?l 2倍样品缓冲液，上样量为20?l。

（2）取10?l样品1溶液，再加入10?l 2倍样品缓冲液，上样量分别为5?l 和10?l。

7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在

沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。

※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散. ※为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.

8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。

9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。

10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。

※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分

11.实验结果分析。

五 绘制标准曲线：

按下式计算相对迁移率：

以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。

六 注意

? 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完全打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。

? 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。

? 已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。

七.思考题

? 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? ? 电极缓冲液中甘氨酸的作用?

? 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? ? 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?