实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

（SDS-PAGE）测定蛋白质的分子量

1 原理

1.1聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理

1.1.1性能

聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。

1.1.2 制备原理

聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。

1.1.3 凝胶浓度和交联度与孔径的关系

凝胶浓度根据被分离的物质的分子量大小确定。当分析一个未知样品时，常先用7.5%的标准凝胶或用4~10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要，胶太软易断裂，；太硬则脆，也易折断。

1.2 SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理

蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于所带净电荷及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。

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实验五  聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析

小麦幼苗过氧化物酶同工酶 

生物111班    杨明轩    1102040128

一、研究背景及目的

过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 - 1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。

而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。

要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。基于 “差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。

同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。

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生物化学实验实验报告

实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳

分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶

生物103班 1002040310 赵宁宁

搭档 1002040301 井 恬

一． 研究背景及目的

电泳现象是自然界存在的一个非常普遍的现象。瑞典科学加Tisellius依据电泳现象发明了电

泳技术，使得根据大分子的特性分离纯化大分子物质技术得到了相当大的进步，他也由此获得了19xx年的诺贝尔化学奖。聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种比较普遍的电泳技术，采用聚丙烯酰胺作为电泳介质，主要分离纯化蛋白质等物质。同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。过氧化物酶是植物体内普遍存在的活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用以及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。本是按采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶的同工酶，根据没的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。

通过本次实验我们将学习并掌握聚丙烯酰胺垂直板电泳技术，熟悉相关操作流程，并且通过分离检测研究过氧化物酶同工酶熟悉过氧化物酶同工酶的作用机理。

二． 原理

1.过氧化物酶同工酶

同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。他们是DNA编码的遗传信息表达的结果。最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定的关系。因此，测定同工酶子啊理论上和实践上都有重要意义。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察，记录和保存。

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用以及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中他的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

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聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

一、目的要求
（1）学习电泳原理和技术
（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术

二、实验原理

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。

聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性
人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：
Acr：丙烯酰胺
Bis：甲叉双丙烯酰胺
AP：过硫酸铵——化学催化剂
TEMED：四甲基乙二胺——加速剂

SDS是一种阴离子去垢剂，SO₃^2-带负电荷。在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。

三、实验材料

（一）试剂

1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1） 称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。

2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。

3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。

4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液 称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。用时可做10倍稀释。

5、10% 过硫酸铵（AP）

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实验7  聚丙烯酰胺凝胶电泳

原理

一  聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10^-2cm），然后再进行电泳分离。

圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。

仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。

 图A

    在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明：

1.样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。 分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。样品在其中进行电泳和分子筛分离。

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Aptamer的稳定性考察—聚丙烯酰胺凝胶电泳

Aptamer识别肿瘤细胞

若选择4℃识别，则需要提前控温离心机，且样品在上样检测前宜放置于冰中；37℃就不用控温了。 Aptamer浓度：荧光标记的是50μM，没有标记的是100μM

DNA提取-----注意实验中戴好橡胶手套，穿好实验服，以防苯酚粘到皮肤上。

1. 取7.3μl aptamer（100μM）于1460μl小鼠血清（无需过滤）中，在37℃细胞培养箱中孵育；

2. 于不同时间点（6h, 5h, 4h, 3h, 2h, 1h, 1min）取200μl该小鼠血清到新的EP管中，加入200μl（等体积）的苯酚-氯仿（取苯酚-氯仿之前先将苯酚-氯仿混匀），混匀，管中溶液变浑浊；

3. 用15000转/分离心10分钟，管中出现3层：上清、白色变性蛋白层、苯酚层；

4. 取上清到新的EP管中。在原EP管（变性蛋白层和苯酚层）中加入200μlTE溶液，混匀（该步进一步提取残留的DNA）；

5. 用15000转/分离心10分钟，收集上清；

6. 重复4、5步直到上清澄清；

7. 在上清中加入等体积的氯仿（用于去除苯酚），混匀，用15000转/分离心10分钟，取上清到新的EP管中；

8. 加入等体积乙醚（用于去除氯仿），混匀后静置10分钟，弃上层乙醚（乙醚比水轻，在上层）；

9. 重复步骤8，敞开管盖15分钟，待乙醚挥发；

10. 加入1/10体积的3M NaAc、2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃冰箱中30分钟（DNA沉淀）；

11. 用16500转/分（转速不宜再高，EP管容易破裂！）离心30分钟；

12. 将管中溶液吸出，转移至新的EP管中。原管中保留约30μl溶液，打开管盖，待管中溶液蒸发；（我通常将EP管敞开，封上封口膜，再扎7、8个孔，放在通风橱中过夜。）（管底看不到沉淀，因为DNA含量太低。）

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琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5-500bp）效果较好，其分辩力极高，甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

琼脂糖凝胶电泳原理：

琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。

琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA,电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖在62 ℃时熔化，因此其中的样品(如DNA)，可以在加热到熔点的水浴中放置一段时间，重新溶解到溶液中而回收。

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