实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析
小麦幼苗过氧化物酶同工酶
生物111班 杨明轩 1102040128
一、研究背景及目的
过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 - 1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。基于 “差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
二、实验原理
1、电泳现象。
带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象成为电泳。电泳现场常受到带电粒子的实际电荷，大小及形状，解离度等因素的影响，因其环境的不同，又表现为受电解质或缓冲液浓度、离子强度、pH、粘度、温度以及电场强度等因素的综合作用。但在支持介质中，电泳的结果往往取决于介质的选择，即电泳受介质性质的影响，例如介质的化学惰性、化学稳定性，均一性以及电渗性质等。
2、凝胶电泳的载体选择
凝胶电泳的介质选择至关重要，而电泳的结果也往往取决于该介质的性质。本实验采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳。聚丙酰胺凝胶电泳是区带电泳的一种。而区带电泳是胶体在惰性支持介质中进行电泳，不同组分形成带状区间。支持介质的存在减少了界面异常现象的干扰和样品的扩散，适用于生物分子的分离和鉴定。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂条件下聚合而成。在小分子量电泳实验中，常采用化学聚合法制备凝胶，所用的引发剂为过硫酸铵（Ap），催化剂为四甲基乙二胺（TEMED）。聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥连接起来，形成纵横交错的三维结构，使凝胶具有分子筛的性质。聚丙烯酰胺凝胶可以通过改变浓度和交联度来控制不同大小的凝胶孔径，取得更好的分辨效果。
其中，聚丙烯氨酰胺凝胶的机械性能好、有弹性、透明、化学上稳定、对pH和温度变化不敏感、没有吸附和电渗作用，且实验所需样品量小，分辨率高，因此是最为常用的支持介质。而采用垂直板电泳，是因为电泳胶板的表面积大，不与缓冲液直接接触，易于冷却控温，且能够在同一胶板、同一操作下同时比较多个样品，便于进行各种鉴定。本次电泳的凝胶系统为不连续系统，即凝胶板分为上层的浓缩胶和下层的分离胶，且缓冲液离子组成和各层凝胶的pH不同。在不连续系统中的电荷效应、分子筛效应和浓缩效应的共同作用下，待测物质能够很好的分离开来，系统的分辨率较连续系统大大提高。因此，实验采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳来实现小麦中过氧化物酶同工酶的分离。
3、凝胶系统
聚丙烯酰胺凝胶电泳是不连续的凝胶系统，其不连续性表现在上下凝胶层的不同组成导致的凝胶浓度和交联度差异，不同凝胶缓冲液导致的凝胶层pH值不同，以及由于pH不同导致的在电场中形成了不连续的电位梯度。
在这个不连续的凝胶系统里，存在着三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应以及浓缩效应，物质的分离主要是在这三种效应的作用下实现的。
电荷效应：各种酶蛋白按其所带有的电荷种类以及数量，在电场作用下以一定的速度向一定电极。
分子筛效应：分子量小、形态为球形的分子在电泳中受到的阻力较小，移动速度快，反之则移动较慢。这与凝胶过滤系统中的分子筛效应是不同的。
浓缩效应：待分离样品中的各组分在凝胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品迅速以高浓度浓缩，原因如下：两层凝胶的孔径不同，在分离胶与浓缩胶的界面会形成压缩层，使稀薄的样品迅速高度浓缩；利用在凝胶介质中Cl-，Gly以及酶蛋白分子三者在不同pH缓冲液中的解离效果不同，进而在前导离子和尾随离子之间形成一个低离子浓度区，即低电导区，从而形成了较高的电位梯度，加速形成酶蛋白区带。而进入分离胶后，由于酶蛋白不再处于低电导区，因此能够在均一的电位梯度和pH条件下泳道，仅按照电荷效应和分子筛效应被分离。
4、条带染色
本实验由于分离纯化过氧化物酶同工酶为生物大分子，难以用肉眼直接进行谱带的分析和处理，因此需要对电泳谱带进行显色处理。此反应中产生氧自由基，能够与联大茴香胺发生颜色反应，产生褐色的化合物，使条带可见，用于分析过氧化物酶同工酶的分离纯化效果。
三、仪器与试剂
实验材料：小麦幼苗；
实验试剂：
实验仪器：DYY-III2稳压稳流电泳仪一套（北京市六一仪器厂）、烧杯50ml×3，微量进样器（上海安亭微量进样器厂）、大培养皿一套、微量可调手动移液器（Dragon）。
四、实验方法
1、贮液配制（教师完成）
按照实验指导39页表格配制贮液。
在配置贮液的时候需要注意：
（1）配好的丙胶贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可存放1~2个月。
（2）过硫酸铵应当天配置。
（3）染色液应当天配置。
（4）电极缓冲液用时稀释10倍。
2、凝胶的制备
（1）将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。
（2）安装电泳槽。安装时，注意旋紧螺丝时要均衡用力，以免夹碎玻璃片。
（3）用2%琼脂封底，以防漏胶。
（4）按下表所示配制分离胶
在小烧杯中混匀后，立即灌胶至据短玻璃片顶端2cm左右。立即用滴管在胶的上层小心轻缓地覆盖2~3mm的水层。再次出现界面后，，再静置一会儿，将水倒出，用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，准备灌注浓缩胶。
（5）按下表配制浓缩胶
混匀后立即灌胶，操作同上，至胶面与短玻璃片顶端平齐，立即插入样品槽模板（梳子）。聚合完成后，在电泳槽内倒入电极缓冲液，使短玻璃片一侧电极缓冲液没过玻璃片顶端，长玻璃片一侧电极缓冲液没过电极丝，然后小心拔出梳子，准备点样。
3、样品的制备（教师完成，已加好溴酚蓝）
称取小麦幼苗叶片1g，放入研钵内，加pH8.0样品提取液2ml，于冰浴中研成匀浆，然后以4ml提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8000rpm离心10min，倒出上清液，以等量40%蔗糖混合，即为样品液1。同上操作，再制备一份小麦幼苗根部的样品液2。
4、点样
向样品液中滴加1~2滴溴酚蓝作为前沿指示剂，然后用微量进样器梯度上样。每种样品分别上样5μl、15μl、30μl、50μl。
5、电泳
接好电源线。打开电源开关，调节电流，初始时控制在10mA左右，当前沿进入分离胶后，可调节电流到25mA左右，待前沿指示剂染料下行至据胶板末端0.5~1cm处，即可停止电泳。整个电泳根据稳流电流大小差异，大约需要3~4小时。
6、剥胶、染色及记录结果
电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地将凝胶置于大培养皿中，进行染色。向大培养皿中倒入大约50ml pH4.7乙酸缓冲液，将胶板淹没，室温浸泡10min。倒掉乙酸缓冲液，加入联大茴香胺染色液，将胶板淹没，室温下浸泡至胶板彻底变白，在此期间会出现过氧化物同工酶的谱带，待染色条带充分显色后观察记录酶谱并分析结果。
五、数据整理
实验得到的电泳条带照片如下图1：
图1 电泳条带照片
六、结果描述与讨论及分析
（一）结果描述与分析
从横向上看，line1、line2、line3、line4所代表的酶是根和叶中所共有的，且都是根中的含量高；说明其在植物生长的不同阶段都起着重要作用，且这两种酶对根的生长发育与功能执行有更大的作用。Line5、line6代表的酶是根中独有的，叶中没有；说明这两种同工酶只在根中发挥作用，那么可以推测其与根独有的功能如离子的吸收等有关。而line7所代表的酶只存在于叶中，说明该酶只在叶中发挥作用，可以推测其功能与叶片特有的功能如光合作用等相关。
从纵向上看，根中共含有6种过氧化物酶同工酶，其含量由高到低依次为line4、line2、line1、line5 line3、line6所代表的酶；这说明line4对根最为重要。且而叶中共含有5种过氧化物酶同工酶，其中line3代表的酶含量最高，line2、line4所代表的酶含量相差不大但均比line7多，line1的酶含量极微小；这表明叶片中存在着较为复杂的生化反应，需要多种酶来催化，而这些反应的重要性差别不大。
总体来看，根中的酶含量要高于叶中的酶含量。分析认为，这是可能是因为鉴于小麦幼苗叶片组织尚未完全发育，其叶片中代谢强度低于根部；而为了满足小麦幼苗对水分、能量及其他营养元素的摄入，根部此时需要大量的酶进行酶促反应以满足幼苗生长的需求。结合叶片与根部存在的主要代谢活动，可以说明过氧化物酶同工酶在植物的呼吸作用、物质交换等过程中起到了重要作用，是植物体内重要的一种酶类。
（二）讨论
我们发现最后得到的电泳条带有较为明显的弥散，尤以line3、line4最为明显。究其原因，一是受到天气、仪器等因素影响，电泳过程中胶板散热不良，造成部分酶降解，分子量发生变化，泳动到不同位置。但只要酶活性中心完整，就能够与联大茴香胺染液显色，就显示出弥散的条带。二是电泳应采用稳压更合适，但过程中由于体系电阻增大，电流下降，所需时间较长，不适用于学生实验。因此本次实验采用的是稳流，但这会造成电泳过程中分子的移动速度不一致，条带弥散。三是由于这是我们第一次做电泳实验，制胶的均一度不够好，体现在line2、line3四组平行梯度没有做到条带平行，影响了实验结果。
七、结论与展望
1、本次实验中，我们共在小麦根和叶中分离出7种过氧化物酶同工酶，根部6种，叶片5种；其中2种为根部独有，1种为叶片独有，4种为二者共有。结果表明，在根和叶中，都有多种酶在起作用，相互配合共同作用于植物的生长与发育。而且不同器官中，酶的含量不同，发挥着不同的作用。
2、电泳技术发明的最初目的是应用于生物大分子的精细分离，但在应用过程中，历经多次改进，最终以其独特的优势成为了样品分析和鉴定的主要技术手段。在现代科学研究中，电泳技术与层析技术相辅相成，相互弥补，共同完成了大量的科研任务。可以预见，二者将在未来的科研中继续扮演重要角色，并得到不断改进与发展。
3、不同的组织和器官的过氧化物酶的同工酶的酶谱差异很大,而大多数组织有其专一的同工酶带。说明在高等植物的生长发育过程中,同工酶的多种分子形式具有阶段特异性和组织特异性。测定该酶或其同工酶的活性变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。种子工作者利用同工酶来测定种子的生活力。因为种子生活力强弱表现在呼吸酶的变化上, 种子发芽率减退时, 其细胞色素氧化酶及过氛化物酶同工酶带就显著减少。若要进行进一步的分析鉴定，可将电泳条带上的酶蛋白剪切下来，经过洗脱，进行分析。这也是使用电泳技术分离纯化的好处。
八、思考题
1、电泳凝胶缓冲系统（电极缓冲液、浓缩胶缓冲液、分离胶缓冲液）在电泳技术中的作用？
答：（1）电极缓冲液的作用
具有导电作用，构成电泳回路的一部分；提供弱碱性的缓冲体系（pH8.3）；提供Gly（pI=5.97），在不同pH下具有相应的解离度；为蛋白样品提供与之相匹配的离子强度；从而使样品具有合适的泳动速度；提供液体环境，帮助胶板散热。
（2）浓缩胶缓冲液的作用
提供前导离子Cl-；提供接近中性的缓冲环境（pH6.7），甘氨酸解离度很小，成为尾随离子，最终形成电位梯度，产生浓缩效应，从而达到将样品浓缩的目的。
（3）分离胶缓冲液的作用
提供pH8.9的缓冲环境，使甘氨酸解离度剧增，消除不连续的高电位梯度，使分离过程仅靠电荷效应及分子筛效应进行。
2、样品中加入40%蔗糖溶液的作用是什么？
答：增加样品溶液的密度，使样液能够沉到样品槽的底部；增加样品的粘度，使样品不容易发生侧向的扩散造成条带弥散甚至对周边条带造成干扰。
3、两侧电泳槽中的电极缓冲液用过一次之后，是否可以回收再用？为什么？
答：正负极槽中的电极缓冲液基本上是相互分离的，没有直接接触，然而由于Tris-Gly缓冲液的初始pH为8.3，电泳过程中电泳槽中发生了水在碱性条件下的电解。下面就阴阳两极反应分别讨论
（1）对于正极槽中的电极缓冲液来说，由于浓缩胶及分离胶中的Cl-始终作为前导离子向正极移动，最终进入到正极的电极缓冲液当中；同时阳极电极反应为，。这两者都会使电极缓冲液成分发生改变，故不能够继续使用。
（2）对于负极槽中的电极缓冲液来说，首先一点是它接触到了样品液，必然会受到一定程度的污染。其次阴极电极反应为4OH-→O2↑＋2H2O＋4e-，结果为阴极一侧pH下降。同时其成分中Gly进入胶板导致溶液中Gly含量下降，故也不能够继续使用。
4、利用电泳技术获得漂亮实验结果的关键因素主要是哪些？为什么？
答：（1）制胶：制胶最重要的是保证胶板的均匀，使大分子在胶板的不同位置受到的作用一致。
首先在配制凝胶的时候，要先把缓冲液、凝胶贮液、去离子水、TEMED混合均匀，最后再加入引发剂过硫酸铵，迅速搅匀后灌胶。避免在灌胶之前或灌胶过程中就发生凝胶的聚合。其次，加入分离胶后，要立即覆盖2~3mm厚的水层，隔绝空气，防止O2淬灭凝胶表面的自由基影响凝胶的均一性。但加水不可过多，避免造成凝胶顶部与下部在含水量上的差异。加水时一定要轻柔，避免冲毁胶面。灌入浓缩胶之前要将水倒出，并用滤纸条洗净，避免两层凝胶之间有水层存在，在电泳过程中造成样品的扩散。但要注意滤纸条吸水不可过度，造成凝胶脱水。最后，插入梳子时要避免带入气泡。
（2）上样：上样要迅速，样品注入后不能再吸出，避免扩散。不同样品上样时，应当以体积小的样相邻，或者样品之间留出一个样品槽，避免样品扩散相互影响。
（3）电泳：选择合适的电流电压形成合适的场强，进而控制样品迁移的速度，电压太大使样品迁移过快，条带不能很好的分离，太小是样品迁移过慢，时间过长，有可能使样品扩散，影响分离效果。电泳结束之后不能直接关闭电源，避免样品发生扩散。停止电泳之后，要立即对胶板进行处理，使条带固定，再进行其他操作。
5、应用或研究的需要和理论上的可行性以及实践中的可操作性是一项技术得以发明的三大前提条件，而完成后的应用实效反过来又会对前期的设计予以进一步修正和指导甚至提出新的问题，比较电泳技术与层析技术的异同点，说明为何基于进一步提高生物大分子纯化水平而被发明的电泳技术，最终却是更为广泛地应用于样品的分析鉴定而并非最初定位的分离纯化？这种转化给我们什么启示？
答：（1）二者的基本原理是相同的。都是根据“差异转化“的思路，将不同物质分子之间的大小、电荷性质、亲和能力等理化性质的差别，在一定条件下转化为运动速度的差异，并通过时间的累积形成运动距离的差异，从而将不同的物质分开。但电泳和层析实现差异转化的方式不同：层析过程中分子运动的动力是其自身的重力，而电泳过程的动力则是电场力。这就造成了电泳体系会发热，进而影响被分离物质的活性。
（2）基于差异转化的原理，要实现大分子更加精细的分级，就要延长运动距离，对于电泳，就是增加胶板长度；而要实现足够大量样品的一次性分离，就要增加上样量，对于电泳就是要增加胶板厚度。这就与电泳技术的动力——电场力产生了矛盾。电流具有热效应，电泳过程中胶板是要发热的。增长、加厚胶板就不利于散热，造成胶板温度上升，大分子失活，达不到最初分离纯化的目的。但是，由于一个胶板上可以同时处理几个不同样品，分离速度相对较快，且处理之后各个样品就分布在同一个平面支持物上，便于进一步的检测与分析。因此，电泳技术最终更加广泛地应用于样品的分析和鉴定。
（3）一方面，技术的发明首先要以应用和研究的需求为动力，以理论上的可行性为基础进行设计，并进行实际应用。但在应用过程中，往往会发现效果达不到最初的设计要求或者是在某些环节的设计上不够完善。这样发现问题之后，就要进行针对性的修正，以期尽可能满足设计的需要。另一方面，对于一个技术方法，有其长处也尤其短处。我们要看到，即使再努力地弥补，短处还是短处，很难赶得上另一种技术的长处。因此，对于短处，只需要弥补到一定程度即可，更重要的是充分发挥长处。