聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理及常见问题分析

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小 和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。19xx年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白 质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改 变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不 再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为

分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。

SDS-PAGE常见问题分析

1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？

在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

2. 样品如何处理？

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。

2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。

3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；

制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

7. 为什么带出现拖尾现象？

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

8. 为什么带出现纹理现象？

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

9. 什么是“鬼带”，如何处理？

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？

我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

11. 为什么电泳的条带很粗？

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；

12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

处理办法：电泳槽正确装配即可。

13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？

这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？

通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

15. 电泳时间比正常要长？

可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

第二篇：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质技术实验分析

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质技术实验分析

聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

一、目的要求

（1）学习电泳原理和技术

（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术

二、实验原理

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。

聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性

人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：

Acr：丙烯酰胺

Bis：甲叉双丙烯酰胺

AP：过硫酸铵——化学催化剂

TEMED：四甲基乙二胺——加速剂

SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。

三、实验材料

（一）试剂

1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1） 称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。

2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。

3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。

4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液 称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。用时可做10倍稀释。

5、10% 过硫酸铵（AP）（6）四甲基乙二胺（TEMED）或β-二甲基氨基丙腈（DMAPN）。

6、10%SDS（十二烷基磺酸钠） 称取SDS 10g，加蒸馏水100ml使其溶解。

7、四甲基乙二胺（TEMED）

8、上样缓冲液 取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液6.25ml，蔗糖10g，SDS 2.3g，1g/L溴酚蓝10ml，加蒸馏水溶解，混合至100ml。

9、考马斯亮蓝染色试剂 考马斯亮蓝R250染色液：浓度为2.5g/L，用甲醇∶醋酸∶蒸馏水=5∶1∶5的溶液配制（V/V）。

10、脱色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸馏水至100ml。

11、样品：人血清。

12、蛋白质分子量标志物 市售中分子量蛋白质分子量标志物。也可选择5种以上的已知分子量蛋白质自行配制，注意其分子量分布要能满足需要，各种蛋白质的浓度基本相等。

（二）仪器 圆盘电泳槽（或垂直板电泳槽）、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床。

四、实验方法

（一）准备圆盘电泳槽、电泳仪。

（二）凝胶制备 按下表分别配制分离胶和浓缩胶（此量可供2人用）

分离胶(12% 5ml) 浓缩胶(5% 2ml)

ddH2O 1.6ml 1.4ml

30%混合液 2.0ml 0.33ml

1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 1.3ml —

1.0mol/L pH6.8 Tris-HCl — 0.25ml

10%SDS 50µl 20µl

10%Ap 50µl 20µl

TEMED 4µl 4µl

注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速用滴管灌胶

（三）灌胶

1、先将胶管（5х90mm）封好底，将配制好的分离胶液灌注入胶管内，约70mm高度（掌握分离胶的高度），在凝胶表面轻轻加一层正丁醇液（约3～4mm）。用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约30～60min。观察胶和正丁醇之间的界面，判断胶是否凝固。要在确认分离胶彻底凝固后才开始配制浓缩胶。

2、分离胶凝固好后，倒掉覆盖在分离胶表面的正丁醇，并用去离子水冲洗一次，倒置吸净残留的水。将配制好的浓缩胶液灌注入胶管内（约15mm），在凝胶表面轻轻加一层正丁醇液（约3～4mm），用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约30～60min。观察胶和正丁醇之间的界面，判断胶是否凝固。胶凝固好后，倒掉覆盖在胶表面的正丁醇，并用去离子水冲洗一次，倒置吸净残留的水，准备加样。

（四）样品预处理和加样

1、取血清0.1ml、上样缓冲液0.9ml，混匀，在沸水中煮沸5min。

2、将胶管封底去掉，放入圆盘电泳槽中，套紧，不能有空的孔，将Tris-甘氨酸电泳缓冲液加入圆盘电泳上、下槽中，电泳缓冲液要盖过胶管口，然后用微量加样器（或注射器）将样品10μl加到胶管胶面内。

（五）电泳 上槽接负极，下槽接正极，先调电压为120v/浓缩胶，开始电泳，当指示染料进入分离胶后，将电压增加到80v/分离胶胶，继续电泳直至染料抵达距分离胶下端约1cm处，停止电泳，断开电源。电泳时间约1.0~1.5h。

（六）考马斯亮蓝染色

电泳结束后，取出电泳胶管，用长注射器针剥胶，一边注水一边推胶，直至胶出。将胶移至大培养皿中，精确量取并记录凝胶长度和指示染料的迁移距离（分离胶上缘到染料条带中心距离），然后将凝胶板浸入考马斯亮蓝染色液中0.5-1h，再用脱色液脱色1~2天，至背景无色为止。区带可作定性或定量分析。

（七）校正曲线的数据处理和分子量测定 精确量取并记录染色后凝胶长度、各标志蛋白质和各待测蛋白质区带的迁移距离（分离胶上缘到各蛋白质区带中心）。按下式计算各蛋白质的相对迁移率（Rm值）。

Rm =

在半对数纸上，以各标志蛋白质的Rm值为横坐标（普通尺度），相应的分子量为纵坐标（对数尺刻度）作图，即得分子量校正曲线。根据各待测蛋白质的Rm值，查此校正曲线，可求各待测蛋白质的相对分子量。

五、注意事项

1．制胶过程中用正丁醇封住胶面是为了阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

2．本法也适合于其他生物样品中蛋白质的分析。上样量不宜过大，否则会出现过载现象。尤其是考马斯亮蓝R250染色，在蛋白质浓度过高时，染料与蛋白质的氨基(－NH)形成的静电键不稳定，其结合不符合Beer定律，使蛋白质量不准确。

3．Acr和Bis有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时要注意保护。

附表1 分子量范围与凝胶浓度的关系

蛋白质 核酸(RNA)

分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)

<104 20-30 <104 15–20

1-4×104 15-20 104–105 5-10

1-5×104-1×105 10-15 105-2×106 2-2.6

1×105 5-10

>5×105 2-5