变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验
一 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
配制溶液：
1、30% Acrylamide（14.5 g 丙烯酰胺，0.5g 双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50 ml，4℃，棕色瓶中储存）
2、 10% 过硫酸铵 （0.5g APS，溶于5ml 去离子水中，4℃可储存数个月）
3、 10 ×TBE 缓冲液（10.8g Tris,0.744g EDTA,5.5g 硼酸，定容到100ml）
4、TEMED
5、20-200 DNA marker
6、 尿素
实验步骤：
1、 配置10%的胶 10ml：8M*10ml*60g/mol=4.8g 尿素
6.1ml water
3.3ml 30% Acrylamide
1ml 10 ×TBE
0.11ml APS
0.01mlTEMED
2、 立即将胶倒入两块板间并插好梳子，放置，待凝固30min，时间可以适当延长。
3、 向电泳槽加入1×TBE，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合的丙烯酰胺。
4、 将DNA marker 加到点样孔中，以120V（10V/cm）进行电泳直到燃料走到靠近底部的三分之一处，大约需要60-90分钟。
二 银染实验
银染溶液的配置：实验之前准备4℃水
1、 固定液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddH2O混匀（通风厨中进行）
2、 染色液：将0.1g AgNO3溶解于100 ml ddH2O中，使用前加1.5ml37%甲醛溶液，必须储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行）
3、 显影液：将30gNa2CO3溶解于ddH2O中，冷却至4℃，使用前加1.5ml37%甲醛溶液（通风厨中进行），0.1M五水硫代硫酸钠 150μl；（0.1M Na2S2O3。5H2O：将2.48g Na2S2O3。5H2O溶于100mlddH2O）。
注意事项：
1、 染色液和显影液要现用现配；
2、 显影液必须在4℃使用且必须保存在4℃；
3、 甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作；
4、 实验室中柔和的背景光线有利于降低背景颜色；
5、 显色不能在透光的盒子中进行；
6、 溶液不能直接倒在胶面上，应使盘倾斜后将溶液倒在盘的角上，或者将每种溶液各方一盘，然后将胶从一个盘转到另一个盘；
7、 溶液的体积必须足够将胶全部浸没；
8、 显色过程中盘中须轻轻摇动。
实验步骤：
1、 固定：用刀子轻轻分开玻璃板，将带有凝胶的一块玻璃板放入盛有200ml固定液的盘
子中，放在水平摇床上摇动20min或直至染料带完全消失
2、 洗涤：把固定液倒回大烧杯中，然后用ddH2O清洗三次，每次2min
3、 染色：把玻璃板放在盛有100ml染色液的盘子里，在水平摇床上摇动30min
4、 显影：把玻璃板在预冷ddH2O中快速过一下（不超过10s），迅速放入预冷（4℃）的
显影液中，显色3-5min或直至所有的带都出现
5、 停止：当出现清晰的条带时，加入先前用过的500ml固定液轻轻摇动，停止显影
6、 用ddH2O将凝胶洗2次，每次2min
7、 晾干，扫描
8、 拍照观察
第二篇：DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染方法的探讨
5黑龙江畜牧兽医620xx年第10期79
DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染方法的探讨
李其松,王金玉,沈 华,戴国俊,杨风萍,陈义权,焦彩兰
(扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州225009)*
中图分类号:S813文献标识码:B
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是聚合酶链反应、
单链构象多态(PCR-SSCP)分析中不可缺少的技
术,多用于单链DNA碱基移位、插入或缺失等基因
变异情况的筛查,还可以广泛用于遗传育种、基因定
位、种子活力测定等方面。银染方法的建立,始于
19xx年对蛋白质的染色,以后逐渐应用于核酸。对
蛋白质与核酸的检测灵敏度可达到纳克水平,促进了
生物大分子结构与功能的研究。电泳完毕后,首先用
固定剂将核酸或蛋白固定到凝胶上,然后使银染剂中
的银离子与之牢固结合,再通过还原剂将银离子还
原,从而发生银棕色显色反应。
1 材料和方法
1.1 材料
垂直板电泳系统,PCR扩增产物;其他生化试剂
均为分析纯。
1.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.2.1 非变性PAGE的制备 分别在足够灌胶体积
的凝胶混合液中加入不同体积的丙烯酰胺贮备液及
相应的DDH2O配制成8%、10%、12%、14%浓度的
凝胶混合液,并加入甲叉双丙烯酰胺(TEMED)
30LL,终浓度为1j的过硫酸胺,终浓度为1@TBE
(由1018gtris、5.5g硼酸、0.7444gEDTA溶于1000mLd2
dH2O配成的混合液)及相应的DDH2O,充分混匀并灌胶。
表1 丙烯酰胺贮备液的制备
丙烯酰胺贮备液/%丙烯酰胺BN,Nc-亚甲双丙烯酰胺
3029B1
2019B1
1.2.2 样品制备 利用不同PCR-SSCP产物作为
样品试剂(上样缓冲液为40%蔗糖水溶液,含
0.025%溴酚蓝,0.025%二甲苯青)。
1.2.3 电泳 上下槽加1@TBE,上样,室温,150V
恒压,电泳至指示染料二甲苯青泳出胶板。
1.3 银染方法
染色方法采用改进的硝酸银染色方法:(1)用
收稿日期:20050919
作者简介:李其松(1981),男,硕士研究生.
通讯作者:王金玉(1952),男,教授,硕士,博士生导师.文章编号:10047034(2006)1000790210%乙醇及0.5%冰乙酸固定10min;(2)用纯化水漂洗;(3)用0.1%硝酸银染色20min;(4)用纯化水漂洗;(5)用1.5%、0.5%甲醛显色。2 结果具体结果见图1~5。图1、图2为不同交联度下的电泳图谱,图3、图4、图5为不同胶浓度下的电泳图谱
。图1 交联度为39B1
的胶图2 交联度为19B1
的胶图3 14%
的胶图4 10%的胶 图5 8%的胶
80
3 讨论
传统的核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳需根据所分离的DNA片段长度配制不同浓度的凝胶,一般在3.5%~20.0%,此试验主要结合其他试验,重在摸索最佳的聚丙烯酰胺凝胶电泳的条件,以检测PCR产物或者DNA。
从试验结果可知,不同的聚丙烯酰胺凝胶交联度对相同的PCR产物进行电泳时会产生不同的结果。在其他条件都相同时高交联度(丙烯酰胺BN,Nc-亚甲双丙烯酰胺为39B1)的聚丙烯酰胺凝胶电泳条带清晰,没有多余的细小条带,在低交联度(丙烯酰胺BN,Nc-亚甲双丙烯酰胺为19B1)的聚丙烯酰胺凝胶可能出现与PCR产物中与目的条带相近的细小条带(俗称影子带),若对目的条带不是很了解,则不利于基因型的判断。
在其他条件相同时,不同的聚丙烯酰胺凝胶浓度对相同的PCR产物进行电泳时也会产生不同的结果,条带相近的PCR产物在高浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳中条带更易压缩,更易分开,而在低浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳中占的体积大,条带较弥散,不易分开,不利于基因型的判断。在低浓度中同一电泳道中的多个条带之间的绝对距离较高浓度的绝对距离
HeilongjiangAnimalScience andVeterinaryMedicine
l102006
要远,同样有利于基因型的判断。
目前,许多实验室PCR扩增的片段主要采用琼脂糖电泳、EB染色。在琼脂糖中用EB染色可检测出少于10ng的DNA,但琼脂糖电泳的分辨率较低,对有些试验不太适用。聚丙烯酰胺的分离效果较好,但如果用EB染色,聚丙烯酰胺淬灭EB的荧光,使EB染色的灵敏度降低,不能检测出少于10ng的DNA。另外,EB染色容易产生污染。用EB染色后,只能用照片记录试验结果,而不能把试验结果及时保存下来为以后的试验做参考和指导。试验采取了银染的方法,同时在试验中我们将染色的方法作了改进。这种方法可提高灵敏度5~10倍,而且避免了EB的污染及紫外光对人眼睛和皮肤的损伤,并缩短了银染的时间。同时改进的染色方法与其他方法相比具有操作时间短、背景颜色浅、操作程序简单、灵敏度高、染色液容易保存等优点。
高浓度、高交联度的凝胶中不同的DNA分子条带更易分开,条带清晰,利于判型;低浓度、低交联度的凝胶中,同一电泳道中的多个条带之间的绝对距离更远,同样利于不同基因型的判断,每位试验者应该根据自己的试验适时调整试验方法,同时选择简单方便的染色方法,可以收到事半功倍的效果。(009)
犬自体皮肤嵌植移植技术
刘学龙,徐文龙,刘运龙,张明华,赵 鹏
(延边大学农学院,吉林龙井133400)
中图分类号:S8581292
文献标识码:B
文章编号:1004
7034(2006)100080
02
嵌植移植技术已经广泛的应用于人医方面,但因
其手术操作要求比较严格,过程比较精细和复杂,尤其是术后护理比较困难,在兽医临床上还难见应用,特别是在我国更是罕见。目前,牛马的自体移植技术已经得到了一定的研究和应用,而嵌植移植技术在犬的应用还是一片空白。此次试验采用一种小块皮片的嵌植移植技术,在犬身上进行自体皮肤移植,取得了满意的结果。此次试验证明,应用同体薄层小块皮片嵌植移植手术方法,皮肤移植成功率可高达85%,同体薄层小块皮片嵌植移植手术是治疗皮肤缺损的一种有效治疗手段,具有显著的兽医临床使用价值。1 试验材料和方法1.1 材料
试验动物:雌性犬1只,体重15kg。
收稿日期:20050805
作者简介:刘学龙(1964),男,副教授,硕士.试验药品:生理盐水、青霉素、消炎粉、云南白药、
眠乃宁、苏醒灵、1%新洁尔灭、5%碘酊、止血敏、75%酒精。
试验器械:手术刀、剃须刀片、组织剪、剪毛剪、镊子、刻度尺、搪瓷盘、口套、铁链、平板、复绷带、小动物多功能手术台及其常规器械(创巾、巾钳、止血钳、纱布、绷带、胶带)。1.2 方法1.2.1 药品制备 将2瓶160万IU的青霉素溶于500mL生理盐水中,摇匀,备用。1.2.2 造创 将1mL眠乃宁肌肉注射于犬颈部进行全身麻醉。将犬保定于小动物多功能手术台上对右臀进行剪毛,用剃须刀片刮去毛根,清洗并消毒(不可使用带有刺激性的消毒剂)。手术切开右臀全层皮肤,切口为8cm@8cm。1.2.3 创面护理 用兑有青霉素的生理盐水冲洗,除去血污、组织碎块,并用2支160万IU的青霉素覆