聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。

聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：

①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有 格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。

②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成 不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子 的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一 般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物 质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含 丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增 加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。

③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。 ④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体，甲撑双

丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝 胶。 在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和

另速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺 成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂放自由基的速度。常用的引发剂 和加速剂的配伍如下表：

聚合反应催化剂配伍

引 发 剂 加 速 剂

（NH4)2S2O8 TEMED

(NH4)2S2O8DMAPN

核 黄 素 TEMED

注：(NH4)2S2O8，过硫酸胺 TEMED：N，N，N，N';四甲基乙二胺 DMAPN：β－二甲基胺基丙晴

用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应；用核黄素引发，需要强光照射反应液， 称光聚合反应。 聚丙烯酰胺聚合反应可受下列因素影响：

1、大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程中要使反应液与空气 隔绝。 2、某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应。

3、某些化学药物可以减慢反应速度，如赤血盐。 4、温度高聚合快，温度低聚合慢。 以上几点在制备凝胶时必须加以注意。

凝胶的筛孔，机械强度及透明度等很大程度上由凝胶的浓度和交联决定。每100亳升 凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度，常用T%表达；凝胶溶液中交联剂 占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示，可用下式计算：

公 式

a：丙烯酰胺克数； b：甲撑双丙烯酰胺克数；m：缓冲液体积（毫升）

凝胶浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；凝胶浓度太低时，凝胶稀软，不易操作。 交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。 聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度，它不防止对流减低扩散的能力，而且因为它具有三

度空间网状结构，某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大 小和形状，这是凝胶的分子筛作用。由于这种分子筛作用，这里的凝胶并不仅是单纯 的支持物，因此，在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外，还必须注意与凝胶本 身有关的各种性质（网孔的大小和形状等）。可通过下式计算来选择适当的凝胶网 孔。

? 2009-5-14 18:59

? 回复

?

? 2楼

公 式

式中：P为

网孔平均

直径，C

为多聚体

浓度，d为

该多聚体

分子直径

（若不是

卷曲的

分

子应为5

A），K为

常数，K

值取决于

涨胶的几

何构型，

假如多聚

体的链是

以近似于

直角

交联的，

则约为1.5

根据此

式，我们

可以通过

多聚体浓

度C近似

地计算出

网孔直

径，例 如已知多聚体浓度为5%，其网孔平均直径应为： 公 式 这样的计算是粗略的，与实际情况有一定距离，有人测定了总浓度（T）为20%的丙烯酰胺液，在六种不同比例的双丙烯酰胺存在 下，聚合后的网孔大小，发现孔径与总浓度有关，总浓度愈大，孔径相应变小，机械 强度增强，与总浓度不变时，甲叉双丙烯酰胺（Bis)的浓度在5%时孔径最小，高于或 低于此值

时，聚合体孔径都相对变大，凝胶孔径在凝胶电泳中是一个重要的参数，它 往往决定了电泳的分离效果。经过不断的实践，得到了如表3所示的经验值，在一般情况下，大多数生物体内的蛋白质采用7.5%浓 度的凝胶，所得电泳结果往往是满意的，因此称由此浓度组成的凝胶为“标准

凝 胶”。 对那些用于重要研究的凝胶，最好是通过采用10%的一系列凝胶浓度梯进行预先

试验，以选出最适凝胶浓度。

表3不同分子量范围的蛋白质和核酸在凝胶电泳 中所选用的凝胶浓度百分率

物 质分子量范围适用的凝胶浓度（%） 蛋白质<10 1-4×104 4×10-1×105 1-5×105 >5×10520-30 15-20 10-15 5-10 2-5 核酸<104 104-105 105-2×10610-20 5-10 2-3.6

聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类，前者指整个电泳系统中所用缓

冲

液，pH值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓

冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨 能力。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小 和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大 小，就可

以用电泳技术测定蛋白质的分子量。19xx年，Shapiro等发现阴离子去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙 醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白 质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电

荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改 变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物 的短轴长度都不一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不 再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量

第二篇：聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析

在很多地方看到大家都在讨论关于聚丙烯酰胺凝胶电泳的知识。看了好多观点以后，不如自己做一个实验来分析。更何况对于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析必须要通过实验来验证观点。下面就是关于聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析：

明确实验目的：

1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作过程。

3.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点和应用范围。

了解实验原理：

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。

聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分为垂直平板电泳和圆盘电泳，两者的原理完全相同。由于垂直板形凝胶具有板薄、易冷却，分辨率高、操作简单、便于比较与扫描等优点，因而为大多数实验室采用。聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率比纸电泳高得多，能检出10-9～10-12g样品，特别适合于分离和测定蛋白质、核酸等生物大分子化合物。它除了能对生物大分子物质进行定性、定量分析外，还可用以测定分子量，且是一种较先进的测定分子量的方法。

不连续变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是使用最广泛的凝胶电泳。不连续是指电泳的pH值不连续（样品浓缩胶缓冲液pH 6.8, 电极缓冲液pH 8.3, 分离胶pH 8.8）、凝胶不连续（一般分成样品浓缩胶和样品分离胶两层）。变性是指样品蛋白经SDS和巯基乙醇作用后，所有蛋白质都解聚成为其构成亚基，并且都带上负电荷，形状都近似于长椭园棒状。这种SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与园棒的长度也就是蛋白质的分子量有关。

SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于灌制凝胶时聚丙烯酰胺的浓度和交联度，二者决定凝胶分子筛的孔径大小，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：

SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围（*双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29）

*丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kD）

15

10

7.5

5.0

实验准备：

一、器材

1.垂直平板电泳仪全套。

2.刻度吸管、三角烧瓶、加样枪等。

二、试剂 12～43 16～68 36～94 57～212

1.30%丙烯酰胺/N, N’-亚甲双丙烯酰胺 以温热去离子水配制成含29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N, N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，过滤后入棕色瓶中置4oC冰箱贮存。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中会在光催化或碱催化下缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，故溶液的pH值不亦超过7.0，且应免光保存。一般在棕色瓶、4oC冰箱条件下可保存数月。

小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。

2.十二烷基硫酸钠（SDS） SDS可用去离子水配成10%（w/v）贮存液于室温保存。

3.TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合，TEMED原液可在4oC冰箱保存。

4、10%过硫酸铵 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。

注意：10%过硫酸铵必须新鲜配制，现用现配。

5.4×1.5mol/L Tris（pH8.8）贮存液（稀释4倍即为分离胶缓冲液）

在300ml去离子水中溶解91g Tris碱（3mol/L），用1mol/L HCl调pH至8.8，加去离子水定溶至500ml，滤纸过滤后置40冰箱保存。

6.4×1 mol/L Tris（pH6.8）贮存液（稀释4倍即为浓缩胶缓冲液）

在40ml去离子水中溶解6.05g Tris碱（0.5mol/L），用1mol/L HCl调pH至6.8，加去离子水定溶至100ml，滤纸过滤后置40冰箱保存。

7.5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液贮存液（稀释5倍即为Tris-甘氨酸电泳缓冲液）

在900ml去离子水中溶解15.1g Tris碱和94g甘氨酸，然后加入50ml 10%（w/v）电泳级SDS贮存液，用去离子水定溶至1000ml。

8.2×SDS凝胶加样缓冲液

100mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)

200 mmol/L DTT（二硫苏糖醇）或10% 巯基乙醇

4% SDS 0.2% 溴酚蓝 20%甘油

9.染色液

在90ml甲醇：水（1:1，w/v）和10ml冰醋酸混合液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250，用Whatmman 1号滤纸过滤后室温保存。

10.脱色液 30% 甲醇+10% 冰醋酸+60%H2O2

实验步骤：

1.配制SDS聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试剂（见试剂部分）

2.分离胶的灌制

（1）根据厂家说明书安装好玻璃板和电泳槽。（2）竖直电泳槽，用融化的1％琼脂封住电泳槽的缝隙。

（3）确定所需分离胶溶液的体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。配胶且寸先加其它试剂，再加过硫酸胺，最后加TEMED。一旦加入TEMED后，立即快速旋动混合物并进入下一步制胶操作。

溶液成分

凝胶浓度8%:

水

30%丙烯酰胺

1.5M Tris

(pH 8.8)

10% SDS

10%过硫酸胺 总体积5ml 总体积10ml 总体积15ml 总体积20ml 总体积25ml 总体积 30ml 2.3ml 4.6ml 6.9ml 9.3ml 11.5ml 13.9ml 1.3ml 2.7ml 4.0ml 5.3ml 6.7ml 8.0ml 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml

TEMED 0.003ml 0.006ml 0.009ml 0.012ml 0.015ml 0.018ml 凝胶浓度10%:

水

30%丙烯酰胺

1.5M Tris

(pH 8.8)

10% SDS

10%过硫酸胺 1.9ml 4.0ml 5.9ml 7.9ml 9.9ml 11.9ml 1.7ml 3.3ml 5.0ml 6.7ml 8.3ml 10.0ml 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml TEMED 0.002ml 0.004ml 0.006ml 0.008ml 0.01ml 0.012ml

（4）迅速在两玻璃板间隙中灌注丙烯酰胺混合溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约1～2mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液，加速凝胶形成。

（5）分离胶聚合完成后（约30分钟），倾出覆盖水层，用滤纸吸净残余水分，再进行下一步浓缩胶的制备。

3.浓缩胶的灌制

（1）按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液

溶液成分

水

30%丙烯酰胺 总体积 3ml 总体积 4ml 总体积 5ml 总体积 6ml 总体积 8ml 2.1ml 2.7ml 3.4ml 4.1ml 5.5ml 0.5ml 0.67ml 0.83ml 1.0ml 1.3ml

1MTris(pH 6.8) 0.38ml 0.5ml 0.63ml 0.75ml 1.0ml

10% SDS

10%过硫酸胺 0.03ml 0.04ml 0.05ml 0.06ml 0.08ml 0.03ml 0.04ml 0.05ml 0.06ml 0.08ml

0.005ml 0.006ml 0.008ml TEMED 0.003ml 0.004ml

（1）在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。

（2）浓缩胶聚合完成后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。

4.样品制备

取0.5ml稀释血清（血清用H2O2稀释一倍）加入0.5ml 2×SDS凝胶加样缓冲液混匀，在100℃水浴中加热3分钟使蛋白质变性。10,000rpm离心1分钟，取上清加样。

5.加样及电泳

用长皮头吸嘴吸取处样品50μl，从加样孔底部缓慢加样。

注意：加样时不得插伤凝胶孔胶面，不得产生气泡、样品不得溢出加样孔。

6.接电源与电泳

上槽接负极，下槽接正极。调节电压至80V电泳至样品前沿刚好进入分离胶后，把电压提高到120V（凝胶上所加电压约为8V/cm），继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm（约2—3小时），然后关闭电源，取出插头。

7.取胶 从电泳装置上御下玻璃，用水果刀撬开玻璃板。并用刀在紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。

8.染色与脱色

用考马斯亮蓝染液对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行室温染色1～2小时后，用脱色液在脱色摇床上脱色3～4次，每次20～30分钟。

血清蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离可以产生十多条色带。

实验注意事项

1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，操作时应免避沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次性塑料手套操作。

2.过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久的过硫酸铵商品不能使用。此外，10%过硫酸铵必须现用现配，4OC冰箱贮存不超过48小时。

3.灌制凝胶时，应避免产生汽泡，因为汽泡会影响电泳分离效果。

4.刚灌注分离胶混合溶液后，应在分离胶液面上加1～2cm高的水层，以阻隔空气。胶液面上加水层时要特别小心，缓缓叠加，以免冲坏凝胶的胶面。

5.聚丙烯酰胺凝胶电泳耗时长，电泳过程中产热多，特别是夏天产热更多。故电泳过程中应安装循环冷却水以带走热量，或在4OC冰箱中电泳。

思考题：

1.简述血清蛋白聚丙烯酰胺电泳的原理和特点。

2.简述本实验的注意事项。

3.简述聚丙烯酰胺电泳的操作要点