无菌原料药生产的无菌工艺验证

作者：佚名    科研信息来源：本站原创    点击数：  854    更新时间：20##-6-9

[关键词]：无菌原料药,无菌工艺验证,模拟介质,培养基,工艺过程模拟

健康网讯：

    无菌原料药的生产通常是把精制过程和无菌过程结合在一起，将无菌过程作为生产工艺的一个单元操作来完成。也称之为无菌工艺。将非无菌的原材料转化为无菌的原料药的方法很多，目前生产上最常用的是无菌过滤法，即将非无菌中间体或原材料配制成溶液，再经0.2μm孔径的过滤器过滤除菌，在以后一系列精制单元操作中一直保持无菌，最后生产出符合无菌要求的原料药。

    典型的无菌原料药精制工艺为：将原材料配制成溶液→过滤除菌→结晶→过滤→洗涤→干燥→粉碎→混合→分装。灭菌过程包括除菌过滤、设备灭菌、包装材料灭菌、衣物灭菌等。这些灭菌过程经过验证方能保证从非无菌状态转化成无菌状态。无菌工艺只有经过验证才能确保产品的无菌性能。验证过程一般是选择合适的介质模拟生产流程，使介质通过整个生产系统，然后取模拟介质培养，观察是否有细菌生长。

    1　验证前的准备

    无菌工艺验证是生产、质量、工程和其它部门之间广泛合作的一项工作。验证前需做以下准备工作。 1.1　生产设施的设计和确认

    生产设施的设计应能使潜在的污染降低到最小，应易于清洁和消毒；产品或物料敞开处的空气要有一定的品质要求；温度和湿度的控制要适宜，应能防止污染和交叉污染。应重视设计上的细节，减少污染源，确保无菌生产。

    1.2　公用工程和环境的确认

    影响产品质量的公用工程如蒸汽、压缩空气、加热、制冷、水系统等都应经过确认，其中任一系统出现故障，都有可能导致产品发生污染。应制订公用工程的维护计划并按计划执行。

    1.3　设备和工艺的确认

    所有的设备、无菌环境、计算机控制系统以及生产工艺都应经过验证。产品暴露是发生污染并导致无菌工艺验证失败的主要原因之一。为防止或降低污染发生的几率，对暴露产品提供百级空气层流罩非常重要；已灭菌的产品在由灭菌器到生产线过程的保护也至关重要，应尽量避免人员对设备或物料的接触性操作。

    1.4　设备的清洗和灭菌规程的确认

    接触模拟介质的设备表面应清洗灭菌，并防止灭菌后的再污染。对生产抗菌性或杀菌性的药品，这种清洗尤为重要。否则会使模拟介质染菌而使验证失败。清洗和灭菌过程应经过验证，保证清洗彻底和灭菌成功。

    1.5　模拟介质的选择和灭菌

    选择的模拟介质应有如下特征：①没有抑菌作用，最好具促进细菌生长的作用。如果选择对细菌生长有促进作用的固体培养介质做验证，对生产环境的保护则特别重要。因为有些操作是使介质暴露，介质的尘粒会飘散在某些较难清洗的地方，如空调系统的送风口和回风口附近，给细菌的滋生创造了条件，所以应有保护措施，尽量使难清洗的死角不被介质污染。②模拟介质应在培养基内有较好的溶解度。如溶解性不好，培养基会发生混浊，影响结果的判断。③模拟介质加入培养基后，不应影响培养基质量和pH的变化，以适应大多数细菌的生长。④对设备无腐蚀性，对人体无害，对环境无污染。

    通常可选用的模拟介质有PEG 4000、PEG 6000、乳糖和甘露醇等。模拟介质在使用之前应灭菌。方法有γ-射线灭菌、湿热灭菌等。在确定灭菌参数后，都应对该灭菌方法进行验证。

    1.6　培养基的选择和灭菌

    一般应针对不同的微生物选择不同的培养基。如需氧菌和厌氧菌适宜用巯乙醇酸盐培养基，需氧菌和真菌适宜用大豆酪蛋白消化物培养基。由于无菌工艺验证前，不知道系统中存在什么样的微生物，而选择多种培养基分别测试又较难做到，因此应根据实际的生产工艺和环境，选择适宜大多数微生物生长的培养基。相比之下，推荐用大豆酪蛋白消化物培养基，因为多数无菌原料药的生产都和空气接触，污染厌氧菌的几率很小，被污染的微生物大多数为需氧菌或真菌。

    培养基灭菌的方法，有γ-射线灭菌法和湿热灭菌法，并对选用的灭菌方法进行验证。培养基灭菌后应做生长促进试验。根据标准操作规程（SOP)制备大豆酪蛋白消化物培养基并灭菌，分装于预定数量的试管中（此数量应有统计学意义）。一半试管中接种枯草芽抱杆菌，接种量＜100CFU（colony forming unit，菌落形成单元）；另一半试管中接种白色念珠菌，接种量＜100CFU。接种后盖塞、封口，分别在（32.5±2.5）0C和（22.5±2.5）℃培养7d,其间应至少有50％以上接种试管培养基中出现明显的所接种微生物生长。

    2　验证的实施

    2.1　工艺条件的选择

    无菌验证的工艺条件要模拟生产实际，并充分考虑可能遇到的条件，以下列举工艺过程中部分工艺条件的选择。

    物料暴露操作：无菌原料药的生产工艺具有设备种类多而复杂、管路长的特点，且不同生产工艺的特点也不尽相同，应根据各自的特点选择固体或液体模拟介质。即使尽量减少设备内部和物料产品的暴露，但仍不可避免有些开口处，则应有呼吸器或百级空气层流保护。验证时应有模拟这些物料暴露的操作。

    结晶操作：有些生产工艺有结晶的操作，因结晶过程有相变产生，是否会影响微生物的生长是一个应考虑的问题，也使模拟过程存在困难。最好的办法是选择2种模拟介质，它们在结晶过程发生反应生成另一种模拟介质，但这样的选择可能会有很大困难。也可用同一种液体模拟介质模拟结晶过程流经所有管路加到结晶罐中。若结晶过程有加晶种的操作，模拟过程中也应有这样的操作，晶种也可用模拟介质代替。为使晶体粒度均匀，有些结晶过程需要降温，在模拟过程中则不应降温，因微生物在低温下不易生长。

    干燥和分装操作：干燥过程中的温度一般会抑制微生物生长，甚至会杀灭微生物，在模拟过程中应保持室温，以免验证失败。也有用冷冻干燥除湿的情况，但模拟冻干参数的选择也不应抑制细菌的生长。总之，为促进细菌生长，允许工艺参数和实际情况不一致，但差别不能太大。无菌原料药的分装量一般较大，在分装过程中应减慢分装速度，以增加产品暴露的机会，在最差状况下进行操作。

    2.2　操作时限

    原料药生产中的每一操作都应有操作时限来保证己灭菌的物品免受微生物的污染或产品变质。操作时限越长，产品受污染的几率越大。在无菌工艺验证时，应将操作时限调整至最大，在最差状况下操作。尤其是己灭菌物品由灭菌到使用时的保存时间更重要，在验证时，应将已灭菌物品至少放置到规定的保存时间。

    2.3　环境监测

    在验证过程中环境的质量至关重要，应在恶劣的环境下进行操作，但又不能使产品染菌。一般采用增加操作人员数量的办法劣化环境。应对环境进行监测以评价验证过程，所有暴露产品的操作都应监测本区域的环境，包括无菌室的温度、湿度、换气次数、尘埃粒子、沉降菌、浮游菌、人员和表面微生物。

    沉降菌和浮游菌用培养皿进行测试，培养基为营养琼脂。培养皿应放置在微生物情况最差的部位。验证过程中，在分装区域放置2个以上的取样培养皿连续暴露取样，并增加取样的频率，暴露时间应为分装的全过程，但不宜超过4h,以免营养琼脂变干而影响细菌的生长。营养琼脂在使用前应做微生物生长促进试验，方法同培养基的生长促进试验。测试浮游菌可用缝隙一琼脂撞击采样法、离心采样法、液体撞击采样法及膜过滤法。一般来说，浮游菌比沉降菌更能反映环境的质量。

    表面微生物的测试可用擦拭法或Rodac碟。用擦拭法测定前应先测回收率，影响回收率的因素有微生物的种类和数量，不同的操作人员进行测试会得到不同的回收率。用Rodac碟测试，方法较方便，但会有营养物质残留在被测试的表面，应清洗干净。

    尘埃粒子测试可以采用不同类型的粒子计数器，目前国际上采用Royco、Climat、Coulter等。尘埃粒子监测的结果应能证明产品暴露的关键区域空气质量达到了100级洁净区的空气质量标准。我国有指导环境监测的国家标准，国际上流行的标准是FS209E,它对环境监测及结果评价给出了很详细的指导。

    2.4　工艺过程的模拟

    由于一般原料药生产工艺都经过结晶过程，其间会有相变。因此，无菌工艺验证不能完全按照原来的实际工艺来进行模拟。可分步完成：①从原材料配制起，以纯化水代替原材料，经除菌过滤、结晶、过滤、洗涤后，从过滤器底部将水放掉。②过滤器蒸汽灭菌，然后加入己灭菌的模拟介质，按生产工艺进行干燥、粉碎、混合、分装。

    生产过程中可能有升温、降温过程，此时应注意模拟介质对温度的敏感性。

    2.5　工艺各步骤中的取样

    生产工艺中每个步骤如结晶、过滤、干燥等都应取样进行无菌测试，取样频率和数量应有代表性，并具有统计学意义。样品取出后不应被污染，最好立即测试。

    2.6　样品培养

    阴性对照：验证过程中，随机取出一定数量的、有代表性的装有培养基的包装容器，作为阴性对照。

    阳性对照：验证过程中，随机取出一定数量的、有代表性的装有模拟介质的包装容器，一半接种浓度＜100个微生物/0.1ml枯草芽抱杆菌，另一半接种浓度＜100个微生物/0.1ml自色念珠菌。接种后分别在适宜的温度下培养7d,其间应至少有50％的接种包装容器中有明显的所接种微生物的生长，以此作为阳性对照。

    样品培养：将分装的产品在操作现场灌装培养基，然后密封，检查密封性。全部产品应在适宜的温度下培养14d,然后检查全部样品的微生物生长情况。若发现染菌应注明批号和包装容器号，同时检查密封情况。若有破损注明原因。污染的样品应做微生物鉴别，至少鉴别到种别。

    2.7　结果评价标准

    在制剂中以污染水平＜0.1％为接受标准，但在无菌原料药生产中，包装单位较大，得到的总分装容器数一般较小，使抽样测试和结果计算失去统计学意义。且生产批量是固定的，因此所有产品都应培养。若发现一个容器染菌，就认为整个无菌生产工艺中有染菌，应立即停产，调查产生污染的原因，采取措施后重复做验证，至少连续3批全部合格才可认为此无菌生产工艺符合无菌要求。

    3　验证报告

    验证完成之后应撰写验证报告，内容包括以下：验证题目、验证目的、参加验证部门和人员、采用的工艺参数和操作时限、选择的模拟介质和培养基、培养条件、验证最终结果和分析、对期望结果偏差的说明。验证报告应由企业质量保证部主管批准。只有当最终结果合格并且验证报告经过批准后，企业的无菌原料药生产才能开始（或继续）进行。

    4　再验证

    再验证的目的是保证无菌生产工艺没有随生产的运行产生污染。应有SOP对再验证的频率做规定。一般新生产线在投产之前要做无菌工艺验证，验证通过后该生产线才能投入使用。正在运行的生产线应每年至少进行2次无菌工艺验证，每个操作人员每年至少参加一次无菌工艺验证，直接接触药品的生产岗位操作人员若有变动，应对产品的无菌工艺进行再验证。 （中国医药工业杂志第35卷第12期）

第二篇：无菌原料药概述

目 录

1 概述 1

2 验证目的 1

3 适用范围 1

4 职责 1

5 验证人员 1

6 验证要求 1

7 验证工艺 2

8 工艺描述 2

9 取样计划及可接受标准 5

10 验证过程 6

11 验证结果与评价 8

12 偏差 10

13 稳定性试验 10

14 再验证 10

1 概述

1.1 产品描述

1.2 公司生产的*****为无菌原料药，其工艺验证主要为工艺过程的验证，包括精制结晶、过滤洗涤烘干、包装和无菌生产验证，以及不溶性颗粒的控制。

1.3 验证采用同步验证，取连续三批试生产批的数据利用制图（或表）统计分析方法进行数据分析。

1.4 本验证是在厂房设施验证、设备验证、设备清洗验证、工艺用水验证、无菌生产验证已完成的基础上进行的。

2 验证目的

通过验证证明*****无菌原料药的生产工艺处于控制状态，所有被定义为关键工艺及控制参数范围已被验证，此工艺能恒定地生产出符合预先规定的质量标准的产品。

3 适用范围

适用于公司*****无菌原料药生产工艺的验证

4 职责

4.1 生产技术部负责验证方案和验证报告的起草、生产计划的安排（包括与各部门的协调）。

4.2 生产车间负责生产的进行和批生产记录的填写。

4.3 质量管理部负责检验方法的验证和中间过程、产品的检测。

4.4 验证工作组负责验证方案和验证报告的审核和批准。

5 验证人员

姓 名 所在部门 职 务 验证分工

6 验证要求

6.1 所有原辅料必须通过各个原辅料测试标准规定的所有项目

主要原辅料检测情况

原辅料名称 产地 批号 质量标准 检测结果 检测报告编号 结论 备注

6.2 所有仪器、仪表均校验合格，所有设备性能确认完好

6.2.1 仪器、仪表校验情况

仪器、仪表名称 编号 型号 测量范围 精度 校验情况 校验人 备注

6.2.2 主要设备验证情况

设备名称 验证时间 验证结果 验证主管

结晶罐

过滤洗涤干燥器（三合一）

6.3 取样：本验证不论何种样品的取样均采用B、M、E制度，即开始、中间和末了，将样品分成三个1/3部分，在每个部分中取样，开始的1/3为B；中间的1/3为M，末了的1/3为E。

6.3.1 验证时的取样除常规取样点外，还必须增加额外的取样点。

6.3.2 每个部位的样品，必须单独测试有关项目。

7 验证工艺

操作规程、质量标准及存放地点

名 称 编 号 存放地点 备 注

*****无菌原料药操作规程

*****无菌原料药质量标准

无菌过滤验证方案

8 工艺描述

8.1 工艺流程图及工序管理点

8.1.1 工艺流程图

溶剂 活性炭

原料 A

A 无菌液

溶剂 活性炭

原料 B

B 无菌液

产品

8.1.2 工序管理点

工序 质量控制点 控制项目 控制指标 检验方法 频次

精制 A

无菌液 澄明度 ≤8点 目测 1次/批

B

无菌液 澄明度 ≤8点 目测 1次/批

结晶 搅拌速度 Hz 变频器 1次/批

温度 ℃ 温度计 随时

过滤洗涤干燥 洗涤 洗涤溶剂量 L 计量 2次/批

洗涤溶剂

澄明度 ≤8点 目测 1次/批

干燥 澄明度 ≤8点 目测 1次/批

真空度 ≤-0.09MPa 真空表 随时

温度 ℃ 温度计 随时

8.2 工艺过程简介

8.2.1 无菌液A制备

将****L溶剂放入不锈钢反应锅中，开搅拌投入**Kg原料A，升温至**℃，待A全部溶解后，加活性炭*kg，搅拌**分钟，将料液放入压滤罐压入预过滤间中间贮罐中，反应锅用溶剂淋洗，也经压滤罐压入贮罐。

将中间贮罐中的A溶液经0.45μm钛棒和0.22μm滤芯精滤压滤到结晶罐。

8.2.2 无菌液B制备

同8.2.1操作，得到无菌液B。

8.2.3 成盐结晶

开结晶锅搅拌，调节搅拌速度至**Hz，于**℃以**L/min速度滴加经精滤的无菌液B，滴毕，调节搅拌速度为 **Hz搅拌**分钟，静置**分钟。

8.2.4 过滤、洗涤、干燥

将结晶液放入过滤洗涤干燥器（三合一）中，抽真空过滤、滤干，放入**L溶剂打浆洗一次，浸泡**分钟，再抽真空过滤，压干，再放入**L丙酮重复上述操作，压干后。将夹套内通入**℃热水抽真空干燥，取样测水份合格（水份≤4.0%）后，出粉。

8.3 关键工艺步骤关键参数及目标控制值

工艺过程 关键工艺参数 工艺参数限度 目标控制值

A无菌液制备 溶解 溶解温度

溶解时间 **℃

**min 溶液澄清

脱色、

预过滤 脱色时间 **min 细菌内毒素≤0.25EU/ml 精滤

（无菌过滤） 滤材孔径

微生物

澄明度 0.22μm 起泡点试验合格

微生物≤10个/100ml

不溶性微粒≤8点

B无菌液制备 溶解 溶解时间 **℃

**min 溶液澄清

脱色、

预过滤 脱色时间 **min 细菌内毒素≤0.25EU/ml 精滤

（无菌过滤） 滤材孔径

微生物

澄明度 0.22μm 起泡点试验合格

微生物≤10个/100ml

不溶性微粒≤8点

成盐结晶 滴加 滴加温度 **℃ 结晶完全 （测母液中A以及产品含量）

滴加速度 **L/min

滴加 搅拌速度

滴加时间 **Hz

**min

搅拌 搅拌速度

搅拌时间 ** Hz

**min

静置 静置时间 **分钟

过滤、

洗涤、

干燥、 过滤 滤材及孔径 20μm烧结板 过滤时间≤ 母液中产品含量≤%

洗涤 初洗涤溶剂用量

浸泡时间

再洗涤溶剂用量

浸泡时间 总杂质A残留量≤0.1%

干燥 热水温度

真空度

干燥时间 水份≤4%

8.4 成品质量标准

表1 质量指标

指 标 名 称 《中国药典》20xx年版

(二部)指标 内控指标

外 观 白色或类白色粉末

或结晶性粉末 白色或类白色粉末

或结晶性粉末

比旋度 （按无水物计算） ＋154 °～＋167 ° ＋154 °～＋167 ° 鉴 别 符合规定 符合规定

检查 溶液的澄清度 ≤1号浊度标准 ≤0.5号浊度标准

溶液的颜色 ≤黄色或黄绿色

4号标准比色液 ≤黄色或黄绿色

3号标准比色液

水份 % ≤4.0 ≤4.0

结晶性 符合规定 符合规定

重金属 ≤0.002% ≤0.002%

热原 符合规定 符合规定

无菌 符合规定 符合规定

澄明度（毛点） ≤8点 ≤8点

含量 %（按无水物计算） ≥97.0 ≥99.0

9 取样计划及可接受标准

工艺步骤 取样部位、频次 检测项目 可接受标准

A

无菌液的制备 溶解 溶液、1次/批 澄清度 小于3#浊度标准 脱色 溶液、1次/批 颜色

细菌内毒素 溶液色≤3号黄色或黄绿色标准

细菌内毒素≤0.25EU/ml

过滤 溶液、1次/批 澄明度

细菌数 ≤8点

≤10个/100ml

B

无菌溶液 溶解 溶液、1次/批 澄清度 小于3#浊度标准

脱色 溶液、1次/批 颜色

细菌内毒素 溶液色≤3号黄色或黄绿色标准

细菌内毒素≤0.25EU/ml

过滤 溶液、1次/批 澄明度

细菌数 ≤8点

≤10个/100ml

精制 结晶液、1次/批 A含量 ≤1%

工艺步骤 取样部位、频次 检测项目 可接受标准

过滤洗涤 过滤 母液 产品

含量 ≤1%

洗涤 结晶物（按B.M.E原则） 杂质含量 最终≤0.1%

干燥 烘干成品 6小时取样 水份 ≤1.0%

7小时取样

8小时取样

包装 成品/随时 全检 符合质量指标

10 验证过程

10.1 验证前的准备与灭菌

10.1.1 洁净区的清洁与消毒

10.1.2 原辅料检验合格

10.1.3 所有的标准、岗位操作法、岗位操作规程应批准

10.2 操作依据

10.2.1 生产操作规程

10.2.2 清洁规程

10.2.3 无菌过滤工艺验证

10.3 A无菌滤液的制备

10.3.1 在过滤前后对过滤器进行起泡点试验

起泡点压力与滤膜孔径的关系：

孔 m 0.1 0.22 0.45?径，

最低起泡点压力MPa 0.67 0.40 0.24

根据所选用的滤膜孔径大小，查看相应的最低起泡点压力，若实测的起泡点压力明显低于该值，则说明滤膜有破损或安装不严密。

起泡点压力 结论 记录人/日期 复核人/日期 备注

过滤（前）

过滤（后）

10.3.2 在溶解过程中，抽样观察溶液澄清度

编 号 起始点 B M E

澄清度

记录人/日期 复核人/日期

10.3.3 无菌过滤后，抽样检测澄明度、细菌内毒素和细菌数

编 号 起始点 B M E

取样量

澄明度

细菌数

细菌内毒素

取样人/日期

培养记录

10.4 B无菌滤液制备

10.4.1 在过滤前后对过滤器进行起泡点试验

起泡点压力与滤膜孔径的关系：

孔 m 0.1 0.22 0.45?径，

最低起泡点压力MPa 0.67 0.40 0.24

根据所选用的滤膜孔径大小，查看相应的最低起泡点压力，若实测的起泡点压力明显低于该值，则说明滤膜有破损或安装不严密。

起泡点压力 结论 记录人/日期 复核人/日期 备注

过滤（前）

过滤（后）

10.4.2 在溶解过程中，抽样观察溶液澄清度

编 号 起始点 B M E

澄清度

记录人/日期 复核人/日期

10.4.3 无菌过滤后，抽样检测澄明度、细菌内毒素和细菌数

编 号 起始点 B M E

取样量

澄明度

细菌数

细菌内毒素

取样人/日期

培养记录

10.5 成盐、结晶，抽取结晶液，将结晶液经0.22μm过滤膜过滤后，液相中A的含量。 滴加

速度

（L/min） 温度

（℃） 滴加 搅拌 静置

起止时间 搅拌速度 起止时间 速度 起止时间

操作人 /日期 取样检测结果 检测人

/日期

10.6 过滤、洗涤、干燥

10.6.1 分离结束后，抽取母液的样品检测母液中产品的含量（包括母液中可能出现的结晶）。 方法：将5000ml母液经0.2μm过滤器过滤，将残渣烘干称重。

母液中产品含量（mg/ml） 记录人/日期 复核人/日期

10.6.2 洗涤

抽取未洗涤时、洗涤1/2及洗涤完毕后结晶物，进行杂质含量测定

洗涤剂用量 洗涤成品杂质残留量检测

未洗涤 0

第一次 1/2

第二次 1

10.6.3 烘干

抽取烘料6小时、7小时、8小时后的烘干物，进行水份测定

真空度 温度 水份检测

6小时 7小时 8小时

记录人/日期 复核人/日期

10.6.4 包装

抽取包装后的成品，进行全检

10.6.4.1 检测报告

11 验证结果与评价

11.1 验证批号

批 次 批 号 验证规模 生产日期

1

2

3

11.2 关键工艺参数验证结果表

序号 工艺步骤 关键工艺参数描述 关键参数限度 验证批工艺参数 第一批 第二批 第三批

1

2

3

偏差及原因：

11.3 收率

收率

批号 预定收率 产量 收率

11.4 产品质量

产品质量验证结果表

化验项目 质量标准 检验结果

第一批 第二批 第三批

偏差及原因：

11.5 无菌过滤的效能

工艺步骤 检测项目 第一批 第二批 第三批

A无菌液

的制备 澄明度

细菌内毒素

细菌数

B无菌液

的制备 澄明度

细菌内毒素

细菌数

偏差及原因：

11.6 过滤洗涤工艺的效能

HLPC纯度

标准 第一批 第二批 第三批

总杂质

偏差及原因：

12 偏差

列举验证中的所有偏差，以及整改措施和追踪依据。

13 稳定性试验

对现行稳定性数据进行分析以便证明产品在整个使用期间内保持其质量指标。 14 再验证：以下情况需进行再验证

14.1 关键工艺过程或工艺参数发生变化。

14.2 产品质量标准改变。

14.3 主要原辅料变更（包括产地变更）。

14.4 主要生产设施、设备改变。

14.5 周期性的再验证，一般不超过3年。