实验二  中性盐沉淀法分离蛋清中蛋白质

一、实验目的

掌握盐析法从蛋清中分离目的蛋白质的技术。

二、实验原理

蛋白质在稀盐溶液中，其溶解度会随盐浓度的升高而增加，此种现象被称作盐溶。但是当盐的浓度继续增高时，蛋白质的溶解度又以不同程度地下降并先后从溶液中析出，此种现象被称为盐析。上述现象是由于蛋白质分子中极性基团之间存在静电力。在低盐浓度下，蛋白质分子中极性基团之间的静电力受盐离子的影响而被消除，蛋白质在水中的极性基团的电荷被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。盐析法就是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。

三、实验用品

1.仪器：100mL锥形瓶；50mL烧杯；50mL带盖离心管；离心机。

2.试剂：蛋白质溶液：5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1：9）；饱和硫酸铵溶液；固体硫酸铵

四、实验方法

1. 取锥形瓶一个，加入蛋白质溶液5.0ml，再加等量的饱和硫酸铵(半饱和硫酸铵)溶液，混匀后静置数分钟，则析出球蛋白。将混合液转移至两离心管(等量)中，2000rpm离心5min，小心将上清夜转移至小烧杯；向沉淀中加少蒸馏水，观察是否溶解，为什么？

2. 向小烧杯中上清液添加硫酸铵粉末，边加边摇，直至不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。转移至两离心管(等量)中，2000rpm离心5min，弃上清，向清蛋白沉淀中加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。

五、实验流程

                

蛋白质溶液 (5.0ml)  +  饱和硫酸铵(5.0ml)

                                     放锥形瓶中，混匀，

                                     静置数分钟

                                       

至两离心管中（等量）

                                     

                                      2000rpm离心5min

 

取上清液至小烧杯                 球蛋白沉淀

添加硫酸铵粉末，              加少量H₂O

                      边加边摇            

至两离心管中（等量）              ？再溶解

2000rpm离心5min

 

弃上清          清蛋白沉淀

加少量H₂O

                         

                              ？再溶解

六、思考题

1. 盐析后球蛋白沉淀加水再溶解后，加热，再加水，是否溶解？

2. 清蛋白沉淀加水后再溶解，用何方法可再沉淀而不变性？

            

                  

第二篇：实验一 蛋白质的沉淀与凝固

实验一蛋白质的沉淀与凝固

蛋白质溶液是一稳定的亲水性胶体溶液。其稳定的因素有二：一是蛋白质胶粒上的电荷使之相互排斥;不易凝集成团；二是胶粒表面的水化膜，它使胶粒与水融恰相依，又在胶粒之间起了隔离作用。如果上述二种稳定蛋白质溶液的因素被破坏，蛋白质将于溶液中沉淀析出。

 一.蛋白质的盐析

[原理]

高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离。因而用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白质一般不引起蛋白质变性，故常用于分离各种天然蛋白质。

    由于蛋白质的组成及性质不同，所以盐析时所需中性盐的浓度也不相同。例如半饱和的硫酸铵沉出球蛋白，饱和的硫酸铵则沉出清蛋白。

    [操作]

　  1.取一试管，加入3m15％蛋白质溶液及3m1饱和硫酸铵溶液，摇匀静止数分钟后观察现象。

　　2.将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达饱和状态。摇匀后观察现象。(注意固体硫酸铵加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。)   

    3.取上项混浊液1m1，加水2ml，观察是否复溶。     

二.乙醇沉淀蛋白质

    [原理]

    乙醇是脱水剂，可与蛋白质争夺水化膜，此外，加入乙醇可使水的介电常数变小，蛋白质解离度降低，带电量减少。故加入乙醇可使蛋白质沉淀。

   用此法在低温下操作可使沉出的蛋白质保持其理化特性及生物学活性，但于室温中操作则往往使蛋白质变性。

   [操作]

   1.取试管4支，标以1、2、3、4号码，按下表操作

2.将3管及4管置冰水浴中，放置5分钟，然后将第4管的冰乙醇倒入第3管中并混匀，同时向第1及第2管中加入未冰浴的乙醇2ml混匀。观察各管的沉淀情况并立即向第1、2及3管中各加入蒸馏水10ml，混匀(注意此步要求迅速)比较各管变化并解释之。

三.重金属盐、生物碱试剂沉淀蛋白质

[原理]

在溶液的PH值大于或小于蛋白质的等电点时，带负电荷或带正电荷的蛋白质可与Pb²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺、Ag⁺等重金属离子或苦味酸、三氯醋酸、钨酸、磷钼酸等生物碱试剂(能使生物碱沉淀的试剂)结合成盐而沉淀析出。用此类方法沉淀的蛋白质往往已失去原有的理化性质及生物学活性。

    [操作]

操作一，取试管4支，按下表操作

混匀，比较各管混浊程度并解释之。

操作二，取试管3支，按下表操作

混匀后观察结果并解释之。     

四.蛋白质的加热凝固    

   [原理]     

   蛋白质在其等电点附近加热，即发生变性凝固。在加热过程中，随着蛋白质变性作用的深化，使已变性的蛋白质分子间凝聚成凝胶状的蛋白块。但应注意，当蛋白质溶液远离等电点而带有很多电荷时，加热虽可使其变性，但并不发生凝固现象。

[操作]

取试管4支，按下表操作:

混匀后各管分别加热，观察有否沉淀析出及沉淀析出的多少，快慢并解释之.另外在第2管加热，蛋白沉出后再加入5ml蒸馏水，观察是否复溶，为什么?

五.试剂

1.5％蛋白溶液：取出鸡蛋清用蒸馏水稀释5倍，搅匀后用纱布过滤。

    2.饱和硫酸铵溶液

    3.硫酸铵结晶粉末     

    4.95％乙醇     

    5.1％乙酸和10％乙酸

    6.30g／L硝酸银溶液

    7.10g／L硫酸铜溶液     

    8.100g／L氢氧化钠溶液    

    9.苦味酸饱和溶液及鞣酸饱和溶液

10.100g／L三氯乙酸溶液