实验9 蛋白质及氨基酸的颜色反应
一、目的和要求
1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊颜色反应及其原理
2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法
二、试剂
1. 鸡蛋清。
2. 蛋白质溶液：将鸡蛋清用蒸馏水稀释10~20倍，3层纱布过滤，滤液冷藏备用。
3. 10% NaOH溶液；20% NaOH。
4. 浓硝酸（比重1.42）；浓盐酸；浓硫酸（分析纯）；冰醋酸（一般含有乙醛酸杂质，故可用冰醋酸代替乙醛酸）。
5. 1% CuSO4溶液。
6. 10% Pb(Ac)2溶液（醋酸铅溶液）。
7. 醋酸铅试纸：将滤纸条浸入10% 醋酸铅溶液中，湿透后取出，100℃烘干即可。
8. 0.5% 甘氨酸溶液。
9. 0.3% 色氨酸溶液。
10. 0.3% 酪氨酸溶液。
11. 0.3% 精氨酸。
12. 0.3% 组氨酸溶液。
13. 0.1% 茚三酮水溶液。
14. 0.1% 茚三酮-乙醇溶液（称取0.1g茚三酮，溶于100mL 95% 乙醇。临用前配制）。
15. 头发；指甲屑。
16. 0.5% 苯酚溶液。
17. 1% α-萘酚乙醇溶液，临用时配制。
18. NaBrO溶液：2克溴溶于100ml 5% NaOH中，置棕色瓶中，可在暗处保存两周。
19. 偶氮试剂：
溶液A：5克亚硝酸钠溶于1000ml水中。
溶液B：5克对氨基苯磺酸溶于1000ml水中，溶解后再加入5ml浓硫酸。
A、B溶液分别保存在密闭瓶中，用时以等体积混合。
三、实验内容
对蛋白质及氨基酸的双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应、坂口反应、乙醛酸反应、偶氮反应、醋酸铅反应等进行定性确定。
（一）双缩脲反应
1、实验原理
当尿素加热到180℃左右时，两个分子的尿素缩合可放出一个分子氨后形成双缩脲，双
缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的红色配合物，此呈色反应称为双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有多个肽键，其结构与双缩脲相似，故能呈此反应，而形成紫红色或蓝紫色的配合物。此反应常用作蛋白质的定性或定量的测定。
2、操作
取一支试管，加入蛋白质溶液约1ml和10% NaOH溶液2ml，摇匀，再加1% CuSO4溶液两滴，随加随摇。观察是否有紫玫瑰色的出现。
注意：CuSO4不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱性溶液中氨或铵盐与铜离子作用生成深蓝色的络离子Cu(NH3)2+4，妨碍此颜色反应的观察。
（二）茚三酮反应
1、实验原理
除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮作用生成黄色物质外，所有α-氨基酸与茚三酮发生反应生成紫红色物质，最终形成蓝紫色化合物。1︰1500000浓度的氨基酸水溶液即能发生反应而显色。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。此反应目前广泛地应用于氨基酸定量测定。
2、操作
（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液和0.5% 甘氨酸溶液各1 ml，再各加0.1% 茚三酮水溶液0.5 ml，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色是否由粉红色变紫红色再变蓝色。
（2）在一块小滤纸上滴一滴0.5% 的甘氨酸溶液，风干后再在原处滴一滴0.1% 茚三酮-乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察是否有紫红色斑点的出现。
（三）黄色反应
1、实验原理
蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这类蛋白质可被浓硝酸硝化生成黄色的硝基苯的衍生物，该衍生物在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中转变为橙黄色的硝醌酸钠。绝大多数蛋白质都含有芳香族氨基酸，因此都有黄色反应。皮肤、毛发、指甲等遇浓HNO3变黄即发生此类黄色反应结果。
2、操作
取6支试管编号后分别按下表所示加入试剂，观察各管出现的现象，若有反应慢者可放置微火（或水浴中）加热，待各管均先后出现黄色后，于室温逐滴加入10% NaOH溶液直至碱性，观察颜色变化。
注意：向蛋白质溶液中加浓硝酸时，所出现的白色沉淀是强酸使蛋白质发生变性所致。
（四）坂口反应
1、实验原理
蛋白质在碱性溶液中与次溴酸盐（或次氯酸盐）和α-萘酚作用产生红色的产物，这是由于蛋白质分子中精氨酸胍基的特征反应。许多胍的衍生物如胍乙酸、胍基丁胺等也发生此反应。精氨酸是唯一呈正反应的氨基酸，反应灵敏度达1：250000。
生成的氨可被次溴酸钠氧化生成氮。在次溴酸钠缓慢作用下，有色物质继续氧化，引起颜色消失，因此过量的次溴酸钠对反应不利，但加入浓尿素，破坏过量的次溴酸钠，能增加颜色的稳定性。此反应可以用来定性鉴定含有精氨酸的蛋白质和定量测定精氨酸的含量。
2、操作
按下表向各管中加入试剂（滴），记录出现的现象。
（五）乙醛酸反应
1、实验原理
含有吲哚基的色氨酸在浓硫酸存在下与乙醛酸（CHOCOOH）缩合，形成与靛蓝相似的物质。此反应机理尚不清楚，可能是由一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合而成的。含有色氨酸的蛋白质也有此反应。
2、操作
取3支试管，编号，分别按下表加入蛋白质溶液，色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2 ml，混匀后倾斜试管，沿壁分别谨慎地加入浓硫酸约1 ml，静置5分钟后，观察各管液面紫色环的出现，若不明显，可于水浴中微热。
（六）偶氮反应
1、实验原理
偶氮化合物与酚核或咪唑环结合产生有色物质，酪氨酸和组氨酸与之反应则产物应分别为橙红色和樱桃红色。含有酪氨酸和组氨酸的蛋白质也有此反应。应当指出，组胺、酪胺、肾上腺素和胆色素分子也能发生此反应而显色。
2、操作
取3支试管编号，按下表分别加入组氨酸、酪氨酸、蛋白质溶液，各4~5滴，再分别加重氮试剂8~10滴，振摇，混匀，取后分别加入20% NaOH溶液2~3滴，观察各试管中有色物质的生成，若水浴加热效果更明显。
（七）醋酸铅反应
1、实验原理
多数蛋白质分子中常有含硫的氨基酸，如半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱作用下可分解产生硫化钠。硫化钠与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀，若加入浓盐酸则有硫化氢气体产生。
2、操作
向试管中加入10% Pb(Ac)2溶液约1ml，再慢慢滴加10% NaOH溶液，边加边振摇，直到产生的沉淀溶解为止。此时再向试管内加鸡蛋清2~3滴，混匀，小心加热，至溶液变黑后，小心加入浓盐酸数滴，黑色褪去，嗅其味，并将湿润醋酸铅试纸置于管口，观察其颜色的变化。
注意事项
1、实验内容繁多，请认真预习、操作
2、操作请按步骤进行
思考题
1、如果蛋白质水解后双缩脲反应呈阴性，对水解作用的程度可作出什么结论？
2、茚三酮反应的阳性结果为何颜色？能否用茚三酮反应可靠鉴定蛋白质存在？
3、黄色反应的阳性结果说明什么问题？
4、为什么蛋清可作为铅或汞中毒的解毒剂？
第二篇：实验4蛋白质的颜色反应和沉淀反应
