实验七植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）

一、实验目的

了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理；掌握分光光度计的使用

二、实验原理

糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。

蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）作用生成蓝绿色的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。上述特定的糖类物质，反应较稳定。该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。

三、材料、仪器及试剂

1.材料：植物种子、白菜叶、柑桔

2.仪器：分光光度计；恒温水箱； 20ml具塞刻度试管（3支） 漏斗；100ml容量瓶；刻度试管；试管架；剪刀；研钵

3.试剂

（1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。

（2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏；

（3）浓硫酸

四、实验方法

1.葡萄糖标准曲线的制作

取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H₂SO₄，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。

2.样品中可溶性糖的提取

称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。

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3,5—二硝基水杨酸比色法测定糖的浓度

1、在样品的总糖提取时，为什么要用浓HCl处理?而在其测定前，又为何要用NaOH中和？

答：总糖测定是建立在还原糖的测定的基础上的，经HCL处理是为了将所有的非还原糖水解还原成还原性糖，经过测定还原糖含量确定总糖含量。

在其测定前用NaOH中和，是因为HCL会消耗菲林试剂，所以必须要先中和来消除其影响。

2、标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么要同步进行？ 答：实验操作时间差别大，吸光度会产生较大误差，虽然溶液在一定时间范围内是保持相对稳定的，但是分光光度计本身存在局限性，要求时间不能太长，所以标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定要同步进行。

3、比色测定的操作要点是什么？方法的基本原理是什么？

答：比色测定方法的原理：用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。即光强度的减弱仅与有色溶液对光线的吸收有关。溶液的浓度C愈大，液层厚度L愈厚（即光线在溶液中所经过的路程愈长），则溶液对光线吸收的愈多。 比色测定的操作要点：进行比色测定时，要选择合适的滤光片，因为有色溶液对光的吸收具有选择性，否则灵敏度很低，导致测量结果不准确。在选择滤光片时，要使滤光片的颜色与待测溶液的颜色为互补色。滤光片和有色溶液具有相似的透光特性，与它们本身颜色相同的色光，能够最大限度地透过。而与它们本身颜色成互补的色光都能被最大地吸收，滤光片最大透过的光线应该是溶液最大吸收的光线。

4、72型分光光度计的原理及使用时的注意事项是什么？

答：72型分光光度计的基本原理：分光光度计计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

使用时的注意事项：对测量浓度有一定的范围要求，吸光度值控制在0.2～0.7之间,并且要求单色光垂直照射样品,试样要均匀，实验室的温度一般控制在10℃～25℃之间，正确选用分光光度计的比色皿，在使用中防止比色皿受污染，每次装入比色皿的溶液不要过满，一般装2/3即可,并在每次倒溶液时应小心操作,减少对进光面的擦洗次数,以防进光面磨损而影响透过率。

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蒽酮比色法

蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。 蒽酮比色法测糖试验 蒽酮比色法测定多糖含量

1、蒽酮比色法测糖试验

一 实验目的 掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法

二 实验原理 蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。

三 实验器材及试剂

马铃薯干粉

可调试移液器或移液管

可见分光光度计（723型）

电子分析天平

水浴锅

电炉子

蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。

标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。

四、操作

1.制作标准曲线

取7支干燥洁净的试管，按表1顺序加入试剂，进行测定。

以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml ）为横坐标作图得标准曲线。

表1 蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作

沸水浴中准确煮沸10min，取出用流水冷却，室温放10min,于620nm处比色

葡萄糖浓度（mg/ml）

2.样品含量的测定

样品液的制作：

精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min（不时摇动）—→取出，

3000rpm离心10min（或过滤）—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形瓶中—→再从中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中

样品液的测定：

（1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却） 表2 蒽酮比色法定糖——样品的测定

（2）加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值。

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植物组织中总糖和还原糖含量的测定（蒽酮比色法） 2010-5-24

一、实验目的

掌握蒽酮比色法测定总糖和还原糖含量的原理和方法，学会正确使用分光光度计。

二、实验原理

游离的己糖或多糖中的己糖基、戊糠醛及己糖醛酸在浓硫酸的作用下脱水生成糠醛衍生物，糠醛衍生物与蒽酮缩合成蓝色的化合物，在620nm处有最大吸收，在一定糖浓度范围内（200ug/ml），溶液吸光度值与糖溶液的浓度成线性关系。用酸将植物组织中没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，或直接提取植物组织中的还原糖，即可对植物组织中的总糖和还原糖进行定量测定。

三、实验材料

1．可见分光光度计、电子天平(1/100)、粉碎机、水浴锅、电炉。

2．研钵、量筒、三角烧瓶、烧杯、容量瓶、玻璃漏斗、试管1.5cm×15cm、刻度吸管、胶头滴管、pH试纸、坐标纸。

3．植物原料，如银耳、木耳、菜叶等。

四、实验试剂

1．蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于l000ml体积分数为80％的硫酸中，当日配制使用。

2．标准葡萄糖溶液(0.1mg／m1)：称取100mg葡萄糖，溶于蒸馏水并稀释至1 000ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）。

3．6mol／L HCl溶液：50ml盐酸，加水至100ml。

4．10％NaOH溶液：称取10g NaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100ml。

五、操作步骤

1．葡萄糖标准曲线的绘制

取干净试管6支，按下表进行操作。以吸光度为纵坐标，各标准液浓度(mg／m1)为横坐标做图。

2．样品中还原糖的提取和测定

称取植物原料干粉0.1～0.5g，加水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。于50℃水浴中保温半小时（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100ml。过滤，取lml滤液进行还原糖的测定：吸取lml总糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。（样品液显色后若颜色很深，其吸光度超过标准曲线浓度范围，则应将样品提取液适当稀释后再加蒽酮显色测定）。

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蒽酮比色法测总糖：

实验步骤：

1、可溶性糖的提取：准确称取烟叶样品0.100克，置于离心管中，加入8毫升80%乙醇，于80℃水浴浸提30分钟，冷却后于4000转离心5分钟，收集上清液，残渣再加入8毫升80%乙醇，再次浸提，重复两次，将三次提取的上清液合并于100毫升容量瓶中并定容至100毫升。

2、总糖的测定：取提取液1毫升（或0.5毫升，视情况而定）于试管中（空白中用1毫升蒸馏水代替），加入蒽酮试剂5毫升，摇匀，于

，冷却后在620nm波长处比色 。

蒽酮试剂：1克蒽酮溶于72%的H2SO41000ml(98%的H2SO4+240的蒸馏水)，棕色瓶冰箱保存2~3周。

3、标准曲线的绘制：取干洁试管6支，依次加入葡萄糖标准液（100μg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml和蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分别加入蒽酮试剂5毫升，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色，记录OD值，绘出标准曲线。

4、计算：C=AN/W

C—样品总糖含量（μg/g）

W—样品重量（g）

A—标准曲线查得的糖量（μg）

N—样品提取液占样品反应液的倍数

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蒽酮比色法测糖

一　目的　

掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法
二　原理　

蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。 本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。　
三　实验器材及试剂
马铃薯干粉、 可调试移液器或移液管 、可见分光光度计（723型）、电子分析天平 、水浴锅 、电炉子
蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。
标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。

葡萄糖标准溶液：称取已在80℃烘箱中烘至恒重的葡萄糖100mg，配制成500ml溶液，即得每ml含糖为200μg的标准溶液。

蒽酮试剂：称取1g经过纯化的蒽酮，溶解于1000ml稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml浓硫酸（比重1.84)稀释成1000ml而成。

2g/L蒽酮试剂：溶解2g蒽酮于1L浓硫酸（98%的浓硫酸）中，当日配制使用。  
四、操作

1．可溶性糖的提取

　　称取重约5g的新鲜植物叶子，于研钵中乙醚少许，仔细研磨成均匀的浆状物，倒入烧杯中，用70℃热水洗涤研钵，洗液并入烧杯中，再加蒸镏水30─40ml。将烧杯放在水浴锅中加热，保持温度70─80℃约半小时，冷却后1滴1滴地加入饱和中性醋酸铅，以除去蛋白质，直至加入醋酸铅时不再形成白色沉淀为止。然后将此混合物连同残渣一并洗入100ml容量瓶中，加水至刻度，充分振荡。以干燥漏斗将滤液过滤于一干燥的三角烧瓶中，瓶中事先放有少量（约0.2─0.4g）草酸钠粉末，以除去滤液中过量的醋酸铅，使生成草酸铅沉淀，再行过滤，所得的透明滤液即为可溶性糖提取液。

2．显色及比色

　  吸取上述糖提取液1ml，放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5ml混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm，测得吸光度。从标准曲线上查得滤液中的糖含量（或经直线回归公式计算），然后再行计算样品中含糖百分数。

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蒽酮比色法测糖

一 目的 掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法

二 原理 蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。 本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。

三 实验器材及试剂

马铃薯干粉

可调试移液器或移液管

可见分光光度计（723型）

电子分析天平

水浴锅

电炉子

蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。

标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。

四、操作

1.制作标准曲线

取7支干燥洁净的试管，按表1顺序加入试剂，进行测定。

以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml ）为横坐标作图得标准曲线。 表1 蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作

沸水浴中准确煮沸10min，取出用流水冷却，室温放10min,于620nm处比色 葡萄糖浓度（mg/ml）

2.样品含量的测定

样品液的制作：

精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min（不时摇动）—→取出，

3000rpm离心10min（或过滤）—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形瓶中—→再从中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中

样品液的测定：

（1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却）

表2 蒽酮比色法定糖——样品的测定

（2）加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值。

（3）以1号试管作为调零管，2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。

3．结果计算：

C×V

w = ———— ×100%

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