实验二十一 可溶性总糖的测定（蒽酮比色法）

一、目的

掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。

二、原理

强酸可使糖类脱水生成糠醛，生成的糠醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质在 620 nm 处有最大吸收 . 在 10 -100ug 范围内其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。

这一方法有很高的灵敏度，糖含量在 30ug 左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。

三、仪器、试剂和材料

1 .仪器

（ 1) 分光光度计

(2 ）电子顶载天平

(3 ）三角瓶： 50m1 X 1

（ 4 ）大试管： 9 支

（ 5) 试管架，试管夹

（ 6 ）漏斗，漏斗架

（ 7 ）容量瓶： 50rnl X 2

（ 8 ）刻度吸管： 1m1X3 ， 2m1X1 ， 5mlX1

（ 9 ）水浴锅

2 .试剂

（ 1) 葡萄糖标准液： l00ug/ml

(2 ）浓硫酸

(3) 蒽酮试剂 :0.2g 蒽酮溶于 100 ml 浓 H2SO4 中当日配制使用。

3 .材料

小麦分蘖节。

四、操作步骤

1 .葡萄糖标准曲线的制作

取 7 支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液：

在每支试管中立即加入蒽酮试剂 4.0m1 ，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸 l0min 取出，用流水冷却，室温放置 10min ，在 620 nm 波长下比色。以标准葡萄糖含量（ ug) 作横坐标，以吸光值作纵坐标，作出标准曲线。

2 .植物样品中可溶性糖的提取

将小麦分蘖节剪碎至 2mm 以下，准确称取 Ig, 放入 50m1 三角瓶中，加沸水 25m1 ，在水浴中加盖煮沸 10min ，冷却后过滤，滤液收集在 50m1 容量瓶中，定容至刻度。吸取提取液 2m1 ，置另一 50m1 容量瓶中，以蒸馏水稀释定容，摇匀测定。

3 .测定

吸取 lml 已稀释的提取液于大试管中，加入 4.Oml 蒽酮试剂，以下操作同标准曲线制作。比色波长 620nm ，记录吸光度，在标准曲线上查出葡萄糖的含量（ ug ）。

查表所得糖含量（ ug ）×稀释倍数

五、结果处理

六、注意事项

1 .该显色反应非常灵敏，溶液中切勿混入纸屑及尘埃。

2 . H 2 SO 4 要用高纯度的。

3. 不同糖类与蒽酮的显色有差异，稳定性也不同。加热、比色时间应严格掌握。

七、思考题

1 .用水提取的糖类有哪些？

2 .制作标准曲线时应注意哪些问题？

第二篇：蒽酮比色法测糖 .doc

蒽酮比色法测糖

一　目的　

掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法
二　原理　

蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。 本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。　
三　实验器材及试剂
马铃薯干粉、 可调试移液器或移液管 、可见分光光度计（723型）、电子分析天平 、水浴锅 、电炉子
蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。
标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。

葡萄糖标准溶液：称取已在80℃烘箱中烘至恒重的葡萄糖100mg，配制成500ml溶液，即得每ml含糖为200μg的标准溶液。

蒽酮试剂：称取1g经过纯化的蒽酮，溶解于1000ml稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml浓硫酸（比重1.84)稀释成1000ml而成。

2g/L蒽酮试剂：溶解2g蒽酮于1L浓硫酸（98%的浓硫酸）中，当日配制使用。  
四、操作

1．可溶性糖的提取

　　称取重约5g的新鲜植物叶子，于研钵中乙醚少许，仔细研磨成均匀的浆状物，倒入烧杯中，用70℃热水洗涤研钵，洗液并入烧杯中，再加蒸镏水30─40ml。将烧杯放在水浴锅中加热，保持温度70─80℃约半小时，冷却后1滴1滴地加入饱和中性醋酸铅，以除去蛋白质，直至加入醋酸铅时不再形成白色沉淀为止。然后将此混合物连同残渣一并洗入100ml容量瓶中，加水至刻度，充分振荡。以干燥漏斗将滤液过滤于一干燥的三角烧瓶中，瓶中事先放有少量（约0.2─0.4g）草酸钠粉末，以除去滤液中过量的醋酸铅，使生成草酸铅沉淀，再行过滤，所得的透明滤液即为可溶性糖提取液。

2．显色及比色

　  吸取上述糖提取液1ml，放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5ml混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm，测得吸光度。从标准曲线上查得滤液中的糖含量（或经直线回归公式计算），然后再行计算样品中含糖百分数。

3．绘制标准曲线

　　准确称取0.1g葡萄糖（分析纯），溶解并用蒸馏水定容至100ml后，分别取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分别加入到50的容量瓶中，并用蒸馏水定容到50ml，配成浓度分别为20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml于试管中，再加入3ml的蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，待几支试管均匀加完后，一起浸入100℃恒温水浴箱中，为防止水分蒸发，应在试管口上加盖一个玻璃球或者加一个塞子，自温度重新升至100℃起计时，准确保温10min后取出，用流动水冷却，然后，于室温中平衡片刻（约10min左右），在分光光度计上，波长620nm处，用0.5cm厚度的比色杯，以空白管做对照空白（此处的空白是指不加葡萄糖的蒽酮试剂，其他反应条件都一致），进行比色。

既得标准曲线。

　如下表格

2.样品含量的测定　　　
样品液的制作：
精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min（不时摇动）—→取出， 3000rpm离心10min（或过滤）—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形瓶中—→再从中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中

样品液的测定：
（1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却）
（2）加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值。
（3）以1号试管作为调零管，2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。
3．结果计算：

                                            C×V

                                 w   = ————×100%

                                               m，

式中w：糖的质量分数（%）
C：从标准曲线中查出的糖质量分数（mg/ml）
V：样品稀释后的体积（ml）
m：样品的质量（ml）

注意事项：

　　1.一定要注意温度要控制在100℃

　　2.从100℃开始准确计时10min,然后迅速冷却，于室温中平衡10min.

　　3.蒽酮要注意避光保存。配置好的蒽酮试剂也应注意避光，当天配制好的当天使用。

4.试管要保证干燥清洁，无残留水滴。