高效液相色谱实验报告

一 、实验目的

1了解液相色谱的发展历史及最新进展

2 学习液相色谱的基本构造及原理

3 掌握液相色谱的操作方法和分析方法，能够通过HPLC分离测定来对目标化合物的分析鉴定。

二 、实验原理

液相色谱法采用液体作为流动相，利用物质在两相中的吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的。当两相做相对移动时，被测物质在两相之间进行反复多次的质量交换，使溶质间微小的性质差异产生放大的效果，达到分离分析和测定的目的。液相色谱与气相色谱相比，最大的优点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质，这类物质在已知化合物中占有相当大的比例，这也确定了液相色谱在应用领域中的地位。

高效液相色谱可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化合物。80%的有机化合物都可以用高效液相色谱分析，目前以已经广泛应用于生物工程、制药工程、食品工业、环境检测、石油化工等行业。

三 、高效液相色谱的分类

吸附色谱法、分配色谱法、空间排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、化学键合相色谱法

四 、高效液相色谱仪的基本构造

高效液相色谱至少包括输液系统、进样器、分离柱、检测器和数据处理系统等几部分。

1 输液系统：

包括贮液及脱气装置、高压输液泵和梯度洗脱装置。贮液装置用于存贮足够量、符合HPLC要求的流动相。高效液相色谱柱填料颗粒比较小，通过柱子的流动相受到的流动阻力很大，因此需要高压泵输送流动相。

2 进样系统：

将待测的样品引入到色谱柱的装置。液相色谱进样装置需要满足重复性好、死体积小、保证柱中心进样、进样时引起的流量波动小、便于实现自动化等多项要求。进样系统包括取样、进样两项功能。

3 分离柱：

色谱柱是色谱仪的心脏、柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。商品化的HPLC微粒填料，如硅胶和以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）等的粒度通常在3μm、5μm、7μm、以及10μm。采用的固定相粒度甚至可以达到1μm，而制备色谱所采用的固定相粒度通常大于10μm。HPLC填充柱效的理论值可以达到50000/m～160000/m理论板，一般采用100-300mm的柱长可满足大多数样品的分析的需要。由于柱效内、外多种因素的影响，因此为使色谱柱达到其应有的效率。应尽量的减小系统的死体积。

4 检测系统：

HPLC检测器分为通用型检测器和专用型检测器两类。通用型检测器可连续测量色谱柱流出物（包括流动相和样品组分）的全部特性变化。这类检测仪器包括示差折光检测器、介电常数检测器、电导检测器和磁光旋转检测器。这类检测器适用范围广，但是对于流动相有响应，受温度变化、流动相流速和组成变化的影响，检测灵敏度低，不能用于梯度洗脱的分离模式。专用型检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感，可用于测量被分离组分某类特性的变化。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器、放射性检测器。

5 数据处理系统：

数据处理系统可以分为数据处理系统和专用智能处理系统两类，前者可以完成一般的色谱数据处理任务，有些软件可以实现部分仪器的控制功能。前者即一般的色谱工作站，后者通常称之为专家系统。

五 、实验数据

数据一：

数据二：

六 、高效液相色谱的使用中的注意事项

流动相：

1 、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；
2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；

样品：

1、 采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；

2、 用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；

手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；

色谱柱：

1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；

2、 使用符合要求的流动相；

3、 使用保护柱；

4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。

5、 色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；

6、 不要高压冲洗柱子；

7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；

第二篇：分析实验报告 高效液相色谱

华南师范大学实验报告

学生姓名：杨秀琼             学号：   20082401129          

专业：    化   学           年级班级：08化二                  

课程名称：仪器分析实验      实验项目：液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯

实验类型：综   合           实验时间：2010/416            

实验指导老师曹立娟老师     实验评分：                     

一、[实验目的:]

1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法

2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术

二、[实验原理:]    

   高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。

   其基本原理：利用欲分配的诸组分在固定相和流动相间的分配有差异（即由不同的分配系数），当两相做相对运动时，这些组分在此两相中分配反复进行，从几千次到百万次，即使组分的分配系数只有微小差异，随着液体流动相却可以有明显的差异，最后使这些组分都得到分离，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

三、[仪器和试剂:]

1.主要仪器：岛津液相色谱仪(LC-10AT)[配有紫外检测PhenomenexO柱]；

10μL微量注射器

2、试剂：

甲醇、水

苯和甲苯混合待测溶液

    苯标准溶液：2.0μL/mL

甲苯标准溶液：2.0μL/mL

苯、甲苯混合标准溶液：1.0μL/mL、2.0μL/mL、5.0μL/mL、10.0μL/mL

四、[实验步骤]

   1、按操作规程开机。

   2、.选择合适的流动相配比，优化色谱条件

   通过调节溶剂甲醇和水的混合比例，从而来优化色谱调剂。

   调好最佳色谱条件，控制流速为1ml/min。柱温30℃，检测波长354nm

   3、苯、甲苯定性分析

    在最佳条件下，待基线走稳后，用10μL微量注射器分别进样10μL苯和 甲  苯混合待测溶液，10μL苯标准溶液（2.0μL/mL）和10μL甲苯标准溶液（2.0μL/mL）(微量注射器用甲醇润洗3～5遍)，观察并记录色谱图上显示的保留时间，确定苯和甲苯的峰。

4、苯、甲苯定量分析

   在最佳条件下，待基线走稳后，用10μL微量注射器分别进样1.0μL/mL、2.0μL/mL、5.0μL/mL 10.0μL/mL的苯和甲苯混合标准溶液10μL。观察并记录各色谱图上的保留时间和峰面积。绘制苯和甲苯混合标准溶液峰面积与相应浓度的标准曲线

5、苯和甲苯混合待测溶液分析

   根据得到的苯和甲苯混合待测溶液的液相色谱图上显示的峰面积值，从绘制的标准曲线上查出苯和甲苯混合待测溶液中苯和甲苯的各自的浓度。

六、实验数据处理及分析

1、色谱条件优化

分析：本次实验分别选择了甲醇：水=60%：40%，70%：30%，80%：20%的溶剂配比，通过比较不同溶剂配比条件下，甲苯和苯的峰宽、保留时间从而确定采用甲醇：水=80%：20%作为本次实验的最佳色谱条件。

2、定性分析

分析：在同一色谱操作条件和进样量下，分别测定试样溶液中苯和甲苯组分及已知苯和甲苯纯物质的保留时间，并将其色谱峰、保留时间与对应的已知苯和甲苯纯物质进行比较，两者基本相同，从而确定混合样品中含有苯和甲苯。

3、定量分析

苯、甲苯混合标准溶液浓度分别为：1 ul/ml, 2 ul/ml, 5 ul/ml, 10 ul/ml。

4、未知样品浓度

七、结果讨论

1、实验中为什么采用标准曲线法作为定量的方法？

答：因为实验中待测溶液的组分只有苯和甲苯两种物质，组分比较简单。只要在实验过程中，严格控制且定量进样，就能采用操作、计算简便的标准曲线法得出准确的实验结果。若采用归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于实验操作、计算复杂，不能快速分析，故实验中采用标准曲线法作为定量的方法。

2．在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。

采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

3．选择流动相时应注意的几个问题

（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和        使检测器噪声增加。

（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。

（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。

（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。

4．影响分离的因素与提高柱效的途径

1）．液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径，降低固定相粒度可提高柱效。

  2）．液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质；（恒温）

  3）．改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。

5.高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点：
(1)进样方式的不同：高效液相色谱只要将样品制成溶液，而气相色谱需加热气化或裂解；
(2)流动相不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；
(3)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小4~5个数量级；
(4)由于流动相的化学成分可进行广泛选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗脱的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率（柱效能）；
(5)高效液相色谱采用5~10Lm细颗粒固定相，使流体相在色谱柱上渗透性大大缩小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相；
(6)高效液相色谱是在液相中进行，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等。

6．高效液相色谱的定性和定量分析的方法

定性：①利用纯物质定性的方法

利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。

利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。

②利用文献保留值定性

相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。

定量：有归一法、内标法、外标法

在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等，但高效液相色谱在分离复杂组分式样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而内标法定量则被广泛使用。