实验原理：

1）G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫—碘复合物从胞内渗出。G-菌的细胞壁结构疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖又均含大量脂质，易被乙醇溶解，导致细胞壁通透性增加，胞内结晶紫-碘复合物被乙醇溶解析出而脱色。

2）G+菌等电点（PI2~3）比G-菌（PI4~5）低，在相同PH条件下，G+菌所带负电荷比G-菌多，故与带电的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。

实验步骤：

一、标本的制备：

1、涂片：

　　取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握菌种管，有搜持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌，待冷却后，取斜面培养的葡萄球菌或大肠杆菌少许与盐水混匀，直接取1~2环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。

2、干燥：

     目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰，以致标本烤枯，不堪检视。

3、固定：

     手执玻片一端，标本面向上，在火焰外层快速地来回通过三次，共2-3秒，以玻片反面触及皮肤不觉过烫为度。冷却后，染色。目的是杀死细菌，是菌体与玻片粘附较牢以及改变对染料的通透性，因活的细菌一般不能使许多染料进入细胞。

二、染色

1、初染：

将涂片标本夹持于左手，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色1~3分钟，用流水缓缓冲洗（即将龙头打开使水缓慢流出，将玻片倾斜使水在玻片面上端沿玻片流下冲洗染液）直至无颜色流下为止。

2、媒染：

加卢戈氏染液4~5滴作用30秒到一分钟，再按上法冲洗，并将片上积水轻轻洒净。

3、脱色：

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实验一：细菌、放线菌的形态

      观察与革兰氏染色

姓名:陈虹邑

学号：200911233012

系别：生物科学与生物技术

班级：周二第一组

试验日期：20##年9月13日

同组成员：邢悦婷  呼波

一、     实验目的及意义

1、巩固油镜的使用;

2、掌握细菌形态观察的基本方法；

3、了解细菌的基本形态和结构。

4、了解革兰氏染色的原理；

5、初步掌握细菌涂片的方法；

6、掌握革兰氏染色的方法；

7、掌握放线菌的涂片方法；

8、观察基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。

二、     实验材料与方法

【实验材料】

菌种：溶血链球菌(Strptococcus haemolyticus),螺菌(Spirillum sp.) ,巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium), 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis), 普通变形菌(Proteus vulgaris), 丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetotylicum), 褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)等细菌永久装片，放线菌5406，金黄色葡萄球菌（staphulococcus aureus），大肠杆菌（E. coli）

试剂：香柏油、无菌水、结晶紫、番红或沙黄、95%酒精、碘液

仪器及用具：显微镜、擦镜纸、吸水纸、小滴管，接种环、载玻片、盖玻片、酒精灯

【实验方法】

细菌的观察

1、在载玻片上滴一小滴水，用接种环，采用无菌操作，将细菌挑起，涂到载玻片上，盖上盖玻片。

2、用显微镜对细菌进行活体观察。观察时先用低倍镜，再用高倍镜，有必要的话，再用油镜观察。

3、观察细菌的永久装片，观察时先用低倍镜，再用高倍镜，有必要的话，再用油镜观察，找到细菌的各种结构。

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华中科技大学微生物学实验报告

班    级：    生物制药1101班        日    期： 20## 年 3 月  16  日

指导教师：   邬建国                 实验组别：  启明七组                  

姓    名：    何明                  组员姓名：  张玉涛、王远馨                   

实验名称：     革兰氏染色                                                      

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一、实验题目：微生物的革兰氏染色

二、实验目的：

1、学习并初步掌握革兰氏染色法；

2、了解革兰氏染色的原理；

3、巩固显微镜的使用。

三、实验原理：

革兰氏染色是1884年丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法。染色步骤分为四个部分：

1、初染：加入碱性染料结晶紫固定细菌图片；

2、媒染：加入碘液，碘与结晶紫形成一种不溶于水的复合物；

3、脱色：利用有机溶剂乙醇或丙酮进行脱色；

4、复染：复红配成碳酸复红作为复染剂。

G-和G+细胞壁的比较：

1、阳性（G+）菌细胞壁特点：细胞壁厚，只有一层，主要由肽聚糖构成，肽聚糖含量高，结构紧密，脂类含量低。当乙醇脱色时，细胞壁肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫和碘的复合物被保留在细胞壁内，复染后仍显紫色（如芽孢杆菌）。

2、阴性（G-）菌细胞壁特点：细胞壁薄，由两层构成，内壁层和外壁层，细胞壁中脂类中脂类物质含量较高，肽聚糖含量较低，网状结构交联程度低，乙醇脱色时溶解了脂类物质，通透性增强，结晶紫与碘的复合物易被乙醇抽提出来，因此，革兰氏阴性菌细胞被脱色，当复染时，脱掉紫色的细胞的细胞壁又着上红色（例如大肠杆菌）。

四、实验器材：

1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。

2、溶液和试剂：革兰氏染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红复染液、水。

3、仪器及其他用品：酒精灯、载玻片、显微镜、接种环、试管架、滤纸、滴管。

五、实验步骤：

1、取一个载玻片，将其洗净并沿一个方向擦拭干净，直至液体不再其上收缩为止；将接种环整平，用灼烧过的接种环在混匀的菌种中取菌，按常规方法图片，应涂大，不宜过厚。

2、打开酒精灯，用火焰固定，不宜烤得太狠，否则菌种呈假阳性。

3、轻旋结晶紫染液滴管，将其旋出，滴加1滴草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位（轻晃使其完全覆盖），染色40s。

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革兰氏染色法

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家 Christain Gram创立。

细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红、稀释复红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。革兰氏阳性菌对青霉素敏感，革兰氏阴性菌对链霉素敏感。可根据革兰氏染色法鉴别不同菌种并对症下药。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。 另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。

G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： １）涂片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。

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实验八 革兰氏染色法

（参考实验教材第9页）

一、实验目的

了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。

二、实验器材

土壤中的微生物，革兰氏染色液（草酸铵结晶紫、碘液、95％酒精、番红），载玻片，接种环，无菌水，显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸。

三、操作步骤

按无菌操作要求，在酒精灯火焰旁进行

1.涂片：

在洁净干燥的载玻片边缘滴一滴无菌水，用接种环取少量菌体与水滴充分混匀；涂在玻片中央，形成薄而均匀的菌膜；

2.干燥：于空气中自然干燥

3.固定：将玻片通过火焰1—2次以使菌膜牢固附着在玻片上；

4.染色

（1）初染：在菌膜上加草酸铵结晶紫一滴，约1分钟，水洗；

（2）媒染：在菌膜上滴加碘液一滴，约1分钟，水洗；

（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，用95％酒精滴洗菌膜至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约30秒钟，立即用水冲净酒精；

（4）复染：用番红液染1分钟，水洗。

5.干燥：将载玻片上的水吸干或于空气中自然干燥

6.镜检：将载玻片置于显微镜载物台上，按低倍镜—中倍镜—高倍镜---油镜的顺序观察。

革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

实验完毕后的处理：

①先用擦镜纸将油镜头上的油擦去；用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次；再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。

②用废纸将载玻片上的香柏油擦干净，再用沾少许二甲苯的纸将载玻片擦干净后放入有洗液的盆中浸泡。

四、实验报告

1．结果：绘出你所观察到的细菌的形态图，并说明它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌。

2．思考题：从初染到复染的过程中，染色成败的关键是哪一步？

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实验一 革兰染色法、细菌的特殊染色法

实验目的：掌握细菌革兰染色的原理与方法；

掌握细菌芽孢染色的基本原理与方法；

熟悉普通光学显微镜的油镜使用与保养方法。

实验材料：菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌

试剂：结晶紫、碘液、95%乙醇、番红花红、孔雀绿

实验内容：

1.革兰染色

染色方法：革兰染色法是细菌学中最广泛使用的一种鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。方法是先将细菌用结晶紫染色，加媒染剂（增加染料和细胞的亲和力）后，用脱色剂（酒精或丙酮）脱色，再用复染剂染色。如果细菌不被脱色而保存原染液颜色者为革兰阳性菌(G＋)；如被脱色，而染上复染液的颜色者为革兰阴性菌(G-)。此染色法可将所有具有细胞壁的细菌分为两大类：革兰阳性菌和革兰阴性菌。

染色原理：现在认为细菌对革兰染色的不同反应主要是革兰阳性菌和阴性菌的细胞壁结构与化学组成不同。革兰阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量多，且交联度大，脂类含量少，经95％乙醇脱色时，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，与细胞结合的结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细胞仍保留初染时的颜色。而革兰阴性菌的细胞壁较薄，含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少，乙醇脱色时溶解外层类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染的颜色。

染色过程：涂片（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）→干燥→固定→初染（结晶紫染色1min）→媒染（碘1min）→水洗→95%乙醇脱色（1min）→复染（番红花红染色1min）→干燥→镜检（油镜）

注意事项：

（1）菌种应选用对数期的菌种；

（2）涂片不易过厚，涂片薄而均匀为好；

（3）脱色不足或脱色过度均会造成革兰染色的假阳性或假阴性，脱色时间

取决于涂片厚度、室温等。

2.芽孢染色

芽孢是某些细菌在生长发育的后期在细胞内形成的圆形或椭圆型的抗逆性比较强的休眠体，是细菌的一种特殊构造。

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