实验八 革兰氏染色法

（参考实验教材第9页）

一、实验目的

了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。

二、实验器材

土壤中的微生物，革兰氏染色液（草酸铵结晶紫、碘液、95％酒精、番红），载玻片，接种环，无菌水，显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸。

三、操作步骤

按无菌操作要求，在酒精灯火焰旁进行

1.涂片：

在洁净干燥的载玻片边缘滴一滴无菌水，用接种环取少量菌体与水滴充分混匀；涂在玻片中央，形成薄而均匀的菌膜；

2.干燥：于空气中自然干燥

3.固定：将玻片通过火焰1—2次以使菌膜牢固附着在玻片上；

4.染色

（1）初染：在菌膜上加草酸铵结晶紫一滴，约1分钟，水洗；

（2）媒染：在菌膜上滴加碘液一滴，约1分钟，水洗；

（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，用95％酒精滴洗菌膜至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约30秒钟，立即用水冲净酒精；

（4）复染：用番红液染1分钟，水洗。

5.干燥：将载玻片上的水吸干或于空气中自然干燥

6.镜检：将载玻片置于显微镜载物台上，按低倍镜—中倍镜—高倍镜---油镜的顺序观察。

革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

实验完毕后的处理：

①先用擦镜纸将油镜头上的油擦去；用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次；再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。

②用废纸将载玻片上的香柏油擦干净，再用沾少许二甲苯的纸将载玻片擦干净后放入有洗液的盆中浸泡。

四、实验报告

1．结果：绘出你所观察到的细菌的形态图，并说明它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌。

2．思考题：从初染到复染的过程中，染色成败的关键是哪一步？

第二篇：实验二 细菌革兰氏染色法

实验三 细菌革兰氏染色法

一、目的要求

1. 掌握油镜的原理和使用方法；

2. 了解革兰氏染色原理；

3. 学习并掌握革兰氏染色的方法。

二、基本原理

1. Gram与革兰氏染色

革兰氏染色（Gram stain）是以丹麦医生Hans Christain Joachim（1853-1938）的名字命名的。Gram在对死于肺炎的患者肺部组织进行检查时发现某些细菌对特定染料有很高的亲和力。

革兰氏染色法的基本步骤是：

a．初染：结晶紫染色；

b．媒染：碘液媒染；

c．脱色：乙醇脱色；

d．复染：番红复染。

经过这样的染色后，发现肺炎球菌保持蓝紫色，肺部组织背景为浅黄色，达到了将细菌与被感染的肺部组织区分开的目的。几年以后，德国病理学家Carl Weigert（1845-1904）在Gram染色方法基础上加上番红复染，使其成为微生物学研究领域最常用的染色方法之一。

2. 基本原理

革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。

革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红）。 

三、实验用品准备：

灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器

四、操作：

1 涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

2 干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

3 固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。

4 初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

5 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

6 媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

7 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

8 脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。

9 复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

10 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

11 干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌

五、实验结果

绘出油镜下观察的混合区菌体图像。

 

                    

混片染色

六、实验报告

1. 革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？

2. 现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性，如何确定你染色结果的正确性？

3. 为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？

4. 你认为革兰氏染色法中哪个步骤可以省略？在何种情况下可以省略？