实验三  细菌的简单染色和革兰氏染色

一、实验目的

1.学习微生物的涂片、染色和基本操作技术。

2.掌握微生物的简单染色、革兰氏染色的基本原理和方法。

3.初步认识细菌的形态特征。

二、实验原理

染色是细菌学中的一项重要的基本操作技术。由于微生物与各种性质的染料具有一定的亲和力，从而使微生物着色，着色后的菌体折光性弱，色差明显。在显微镜下容易观察细胞的内部结构及其内含物，因此，微生物染色是进行微生物形态观察的重要方法之一。染色分为单染（简单染色），复染（革兰氏染色）。单染较简单，以同一种染料让菌体着色，以显示微生物的形态。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如沙黄）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。

1884年由丹麦病理学家C. Gram创立了革兰氏染色法，后来一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂(乙醇)处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、含脂量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫——碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、含脂量高，当用脱色剂(乙醇)处理后，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的准确性，采用规范的染色方法是十分必要的。本实验将介绍目前普遍采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。

三、实验用品

(一)材料：

        菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

普通变形杆菌（Proteus vulgaris）

    (二)器材：显微镜、酒精灯、接种环、香柏油、二甲苯、牙签、载玻片、纱布、滤纸、擦镜纸、镊子、染色缸、火柴、玻片架、烧杯等。

(三)染色液：简单染液：齐氏（Ziehl）石炭酸（苯酚）复红染液、吕氏美蓝染液、草酸铵结晶紫染液（初染液）、卢戈氏（Lugol）碘液（媒染液）、95%乙醇溶液（脱色液）、沙黄乙醇溶液（复染液）  。

四、实验操作

1.简单染色法

（1）涂片

取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取l～2环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央，用接种环以无菌操作（图3-1，）分别从枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于生理盐水水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上（图3-1）。

    注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。

（2）干燥

室温自然干燥或火焰干燥。

（3）固定

涂面朝上，通过火焰2～3次。此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。

热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。

（4）染色

将载玻片平放于玻片搁架上，滴加染色液于涂片上（染色液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。吕氏碱性美蓝染色时间约1～2min；石炭酸复红（或草酸铵结晶紫）染色约1min。

图3-1 无菌涂片法 (引自杨文博，2004)

（5）水洗

弃去染色液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。

水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。

（6）干燥

自然干燥、火焰干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。

（7）镜检

涂片干后才能镜检。

涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。

（8）结果见图3-2、3-3。

图3-2  金黄色葡萄球的形态             图3-3  枯草杆菌的形态

2. 革兰氏染色

（1）制片

取菌种培养物用同单染色方法进行涂片、干燥、固定。

要用活跃生长对数期的培养物作革兰氏染色菌种；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。

（2）初染

滴加草酸铵结晶紫（以刚好覆盖菌膜为宜）染色1～2min，水洗。

（3）媒染

用卢戈氏碘液冲去残水，并用卢戈碘液覆盖约1min，水洗。

（4）脱色

将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇不出现紫色时为止，立即水洗。

革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不够，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。

（5）复染

用沙黄乙醇染液复染约2min，水洗。

（6）镜检

干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌(G⁺)，被染成红色的为革兰氏阴性菌(G^-)。

（7）混合涂片染色

按找上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。

图3-4  混合涂片染色（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）

五、实验建议

采用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌约24小时营养琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌则为12-20小时营养琼脂斜面培养物。

在同一载玻片上，以大肠杆菌和枯草杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片，革兰氏染色，镜检进行比较，以检查染色操作是否准确。

六、实验报告及作业

1、绘图表示染色结果。

2、简述革兰氏染色基本原理和具体操作步骤。

3、革兰氏染色成败关键是哪一步？

                                            （李能树  荚  荣）

第二篇：实验一二三 细菌染色

实验一、细菌简单染色

一、实验目的与要求

1 .学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法

2 .掌握油镜的使用方法和无菌操作技术

二、原理

1 .简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

2 .常用碱性染料进行简单染色，因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染料有：美蓝、结晶紫碱性石炭酸复红等。

三、器材1.菌种

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）

2.染色剂：石炭酸复红染液

3.仪器及其他用具

显微镜 酒精灯 载玻片 接种环 双层瓶 擦镜纸 蒸馏水

四、操作步骤1.涂片

取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从金黄色葡萄球菌和苏云金芽胞杆菌平板上挑取少许菌苔于水滴中，混匀成薄膜。

注意：载玻片无油迹；滴蒸馏水不要太多；涂片要涂抹均匀

2.干燥

室温自然干燥

3.固定

涂面朝上，通过火焰2-3次，热固定温度不宜过高，以免改变或破坏细胞形态。

4.染色

滴加石炭酸复红染液于涂片上，染色约1-2分钟5.水洗

用自来水冲洗，直至涂片上流下的水为无色为止。

注意：不要直接冲洗涂面，使水从载玻片的一端流下。水流不宜过大，以免涂片薄膜脱落

6.干燥

自然干燥或用吸水纸吸干

7.镜检

涂片必须完全干燥后才能用油镜观察

五、实验报告根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。

实验二、革兰氏染色法

一、目的要求

1.学习并掌握革兰氏染色法、荚膜染色法

2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性

二、基本原理1.革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C. Gram氏创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法。）

2.革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。当结晶紫初染后，像简单染色一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色，碘液作为媒染剂，它能与结晶此结合成结晶紫－碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力，当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果不同，G＋细菌的细胞壁主要由聚糖组成网状结构，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫－碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。G－细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫－碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂红色。

三、实验器材1.菌种

大肠杆菌（E coli）

枯草芽胞杆菌（ Bacillus subtilis） 巨大芽胞杆菌（Bacillus megatathium）

2.染色剂

革兰氏染色液

3.仪器及用具

显微镜 酒精灯 载玻片 接种环 双层瓶 擦镜纸 蒸馏水

四、实验步骤1.制片

常规涂片、干燥、固定

2.初染

滴加结晶紫，染色1~2分钟，水洗。

3.媒染

用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗。

4.脱色

吸水纸吸干玻片上的残水，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至乙醇无紫色，立即水洗。脱色时间约20~30秒。

5.复染

用番红液复染约2分钟，水洗。

6.镜检

干燥后，用油镜观察

菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。

五、实验报告1.列表简述2株细菌的染色结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应。

2.你认为在革兰氏染色过程中最关键的环节是哪一部，为什么？

实验三、细菌芽孢染色法

一、目的要求

?1.学习并掌握芽孢染色法

?2.初步了解芽胞杆菌的形态特征

二、实验原理芽孢染色的基本原理：用着色力强的染色剂孔雀绿染色后，被染色的芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。

三、实验器材

1.菌种

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）

2.染色剂

饱和孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液

3.仪器及用具

显微镜 酒精灯 载玻片 接种环 双层瓶 擦镜纸 蒸馏水

四、实验步骤1. 制片

常规涂片、干燥、固定

2. 染色

加3~5滴饱和孔雀绿染液于涂片上 ，维持10分钟以上

3. 水洗

用缓流自来水冲洗，直至流出的水为无色为止

4. 复染

用番红染液复染2分钟

5. 水洗

用缓流水冲洗，吸干

6. 镜检

干后用油镜观察：芽孢为绿色，芽孢囊及营养体为红色

五、实验报告

绘制苏云金芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌图（注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形状特征）。