实验二细菌的分离和革兰氏染色

一、             实验目的

1．  掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤；

2．  掌握革兰氏染色法的步骤和关键点；

3．  识别细菌的革兰氏染色结果；

4．  学习无菌操作技术 。

二、             实验原理

    一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。

    虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。

三、             实验器材

载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液；

结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液；

枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌

平板，大肠杆菌平板，牙垢。

四、实验步骤

1、  涂片

左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。

室温下自然干燥。

2、  固定

    手持或镊子夹载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。

3、  初染

    滴加1滴草酸铵结晶紫染液，染色1分钟，水洗，吸干。

4、  媒染

    用碘液冲去残留水，再加1滴碘液覆盖涂片1分钟，水洗，吸干。

5、  脱色

    用吸水纸吸去玻片上的残留水，滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片，倒掉脱色液，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，吸干。脱色时间20~30秒。

6、  复染

    滴加1滴蕃红染液复染1-3分钟以上，水洗。

7、  显微镜观察

吸干载玻片背面及标本周围水渍，先用4*10的倍数找到合适的视野，再油镜观察。

五、             实验结果

6张装片的实验结果见表1，照片见图1。

表1 . 各菌种的染色结果及形态特征

   

 

                 （a）枯草芽孢杆菌，10×100倍放大

 

                      （b）金黄色葡萄球菌，10×100倍放大

 

                   （c）大肠杆菌，10×100倍放大

 

                    (d)未知菌，10×100倍放大

 

                       （e）酵母，10×100倍放大

 

                     （f）牙垢，10×100倍放大

                   图1. 微生物革兰氏染色显微照片

六、             讨论

1．  涂片时的干燥

    在涂片时，如果是直接调菌液，则用接种环一蘸即可，如果是从平板菌落上取样，事先滴水时千万不要滴太大的液滴，总之是为了使涂片尽快干燥。如果不慎水加多了，不能用吸水纸吸，因为此时还没有固定，会将大部分细菌吸走。可考虑放到酒精灯上方较远处，微热干燥，以手心能感到温暖为宜。不能太低，会对细菌造成杀伤。

2．  固定

    本次实验中较难掌握度的一步。在火焰上方约10cm处来回过3～4次即可。固定不充分的话后续清洗时会将细菌洗掉，固定过热的话又将细菌烧焦，不能上色。需要注意的是，热固定会改变细菌的内部结构和外形，若研究菌体细胞结构时还是要用化学固定法。

3．  脱色时间

最难掌握度的一步！脱色时，最初洗下的酒精都看不出初染的蓝色，也就无法判断脱色是否充分，所以只能通过多次实验，建立洗脱时间梯度来逐步摸索。我们的金黄色葡萄球菌做了3次才得到勉强理想的染色结果。个人觉得用不了书上说的30s，洗2次大约15s就足够了。

基础实验，我们可以根据已知的菌种知识来调节洗脱时间，比如G^＋就洗短点，G^－就洗长点，但是对于以后的未知菌种，这样做是不可以而且不可能的！所以一定要在基础试验中打下扎实的革兰氏染色操作基础，标准化动作，以后才能对未知菌种做出正确鉴定。

4．  大肠杆菌的复染

老师事先提醒过大肠杆菌不好染色，复染可延长时间。我们复染5分钟后镜检，发现染色效果不理想，于是小心地拆下盖玻片不使镜油污染样品，再次滴加蕃红染色5分钟，累计10分钟复染。第二次镜检的结果就好多了。说明我们的补救方法是可行的。

另外，我们对面是几位重做实验的同学，助教为他们准备了大肠杆菌平板。一开始我们误将此板当作酵母，根本没考虑二者菌落外形的巨大差异，制片后一致在困惑酵母怎么这么小而且是阴性的（我们居然分不清菌落特征却还记得分清细菌个体），重复制片结果仍然如此！苦恼中求助助教，才发现取错样品了。拿到酵母平板后，惊叹于二者菌落外形差异如此巨大我们却没有注意到，看来上次课观察平板写完报告后就忽略了。这提醒我们即使是基础教学试验这种材料很固定的实验也要小心，自己要有判断能力，而且千万不能忘了前面的成果。值得一提的是，我们一共做了3块大肠杆菌片子（2固1液），染色都很不错，有的同学却染了一下午才得到理想结果。我们可谓“无心插柳柳成荫”了。这同时也说明，平板比液体培养基适于做染色实验。

5．  染色结果

    这次报告中唯一不理想的染色是枯草芽孢杆菌，是我同组制作的。但是这张片子我当时看过，的的确确是紫色！这是我们第一张片子，照相前非常谨慎，请教助教鉴定后才决定拍照的，不知道为什么在数字摄影的成像系统下就失真了。肉眼观察可是千真万确的阳性结果啊……本想像以前处理实验结果一样PS一下，突然意识到这次是染色实验，看的就是颜色结果，PS就毫无意义了。所以只好忍了，暂且算作假阴性吧。这再次说明，摄影技术发达的今天，肉眼仍然是不可替代的。

6．  酵母菌能进行染色吗？结果如何？为什么？

    能，显革兰氏阳性结果。酵母的细胞壁不含肽聚糖，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖，还有几丁质等，它们都是多糖的复杂分支聚合物，不溶于乙醇，且酵母细胞壁脂类较少，因此在媒染后，结晶紫-碘复合物不易脱出细胞壁，故呈现革兰氏阳性反应。

第二篇：微生物实验报告：普通染色和格兰染色

实验二 细菌的分离和革兰氏染色

一、 实验目的

1． 掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤；

2． 掌握革兰氏染色法的步骤和关键点；

3． 识别细菌的革兰氏染色结果；

4． 学习无菌操作技术 。

二、 实验原理

一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。

虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。

三、 实验器材

载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液；

结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液；

枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌 平板，大肠杆菌平板，牙垢。

四、实验步骤

1、 涂片

左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。

室温下自然干燥。

2、 固定

手持或镊子夹载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。

3、 初染

滴加1滴草酸铵结晶紫染液，染色1分钟，水洗，吸干。

4、 媒染

用碘液冲去残留水，再加1滴碘液覆盖涂片1分钟，水洗，吸干。

5、 脱色

用吸水纸吸去玻片上的残留水，滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片，倒掉脱色液，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，吸干。脱色时间20~30秒。

6、 复染

滴加1滴蕃红染液复染1-3分钟以上，水洗。

7、 显微镜观察

吸干载玻片背面及标本周围水渍，先用4*10的倍数找到合适的视野，再油镜观察。

五、 实验结果

六、

讨论

第三篇：微生物实验报告模板

注：这个范本是根据师兄留下的遗产修改而成，基本了概括整个实验的流程，为了大家不要雷同，所以只写了标题，但是还是有一些小步骤没有记录进去，如油镜的使用，但是这些我们之前都学过了，所以有所取舍吧。大家认真看看吧。里面可能编号有点不合理或者什么的，请大家根据自己情况修改，不用写电子报告的实验的同学，也请按照这份报告写在纸质版的报告册上，如果发现问题，第一时间和遂和联系。谢谢。

脓汁和粪便标本中病原菌的检测

年级专业：

学号：

姓名：

1.实验目的：

（主要写脓汁和粪便标本中病原菌的检测，另外附加一些辅助实验的目的，如了解并熟悉微生物实验操作方法，实验方法等等）

2.实验器材：（还没有写完）

 接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架…………

3.实验方法与步骤：

3.1培养基的制备

培养基制备的一般程序：

3.2空气、手指皮肤的细菌学检查

3.3细菌的分离与培养：

采用平板划线分离法，取脓汁标本在普通平板表面划线，取粪便标本在伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个细菌，在37℃培养18～24h ，从而分离出单个菌落。

3.4细菌的纯培养：

取脓汁标本在普通平板上的黄色、白色单菌落，粪便标本在伊红美蓝平板上的紫黑色、淡粉红色单菌落接种在四个斜面培养基，标记，在37℃培养18h。

3.5细菌的形态学检查

3.5.1革兰染色法观察细菌形态

涂片  →  干燥   →  固定→染色。涂片：取一玻片在玻片的左右两侧上加生理盐水3～4ul，2滴，分别取黄色和紫黑菌菌苔少许（1mm小菌落的半量）与左右两侧盐水混匀，涂成1cm2。干燥：在空气中放置至干燥。固定：在酒精灯上来回横穿2到3次对其进行固定。染色：结晶紫 → 初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗稀释→复红→复染1分钟→水洗→吸干,镜检。

3.5.2取另一玻片，取白色和粉红色菌苔，操作与上述同。

3.6细菌的生化试验 

3.6.1糖发酵试验

用接种针分别挑少许紫黑和粉红色的细菌接种到葡萄糖发酵管和乳糖发酵管中，在37℃下，培养24小时，观察其产酸产气情况。

3.6.2细菌药物敏感性试验 

接种环分别取黄、白、紫黑、粉红色四种菌液3～6ul×2环，各自在四个平板上，作平板密集划线接种细菌（纱窗样）。设计三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。37℃18～24小时培养，观察结果。

3.6.3血浆凝固酶试验 

取二滴兔血浆置于洁净的玻片上，分别用接种环取白色和黄色菌苔(2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合，涂匀呈云雾状，立即观察结果。

3.6.4半固体接种法  

接种针斜面取四种不同颜色的细菌，各自接种进四个半固体培养基，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种针。 在37℃下,培养24小时，观察结果。

3.6.5 痢疾血清玻片凝集反应 

取载玻片1张，滴加痢疾血清和生理盐水各15ul，2滴。用接种环挑取少许紫黑色菌落和粉红色菌落，各自与上述混合液液滴混匀，观察结果。

4.结果观察，记录，分析讨论

4.1结果观察

(注：凡是有实验现象的都记录下来，可以放图片，最好和实验记录相对应，有怎样的实验观察就有对应的实验记录)

4.2实验记录（我只提供部分的记录表格，也可以用文字记载，有一些需要大家自己作表格；另外，里面的表格有一些是附表，不是实验记录表）

4.2.1

  

4.2.2手指的细菌学检查

………………………

4.2.3

4.2.4

4.2.5血浆凝固酶实验记录

………………

4.2.6痢疾血清实验记录

………………

由上述实验结果可得脓汁和粪便标本细菌检测结果如下表：

4.3实验结果与讨论

4.3.1

4.3.2………………………………