20##级制药专业
工业微生物学实验报告
姓名: 刘甜甜 学号: 2012304090
班级: 制药12-2班 指导老师：王健
日期：2014.6.11
一、实验目的
1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。
2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。
3、了解细菌的形态特征、染色特点。
4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。
5、掌握细菌分离划线培养的方法。
6、掌握细菌的初步生化反应。
7、掌握细菌密集划线法，掌握细菌K-B药敏纸片法。
二、实验内容
1 细菌Gram’s stain染色，镜检，观察记录细菌形态和特色特征
1.1 实验原理：染色原理：G+菌与Gˉ菌细胞壁不同，G+菌比Gˉ菌细胞内核糖核酸镁盐含量高，G+菌比Gˉ等电点低。
1.2 实验步骤：
1.2.1.制片：1涂片：取半滴生理盐水置一洁净玻片上，以无菌操作技术自平板上去菌落少许，与生理盐水混匀，均匀涂布约1cm2大小，自然干燥；
②固定：取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次，使菌膜牢固附于玻片表面；
1.2.2染色：①初染：取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,细流水冲洗，切勿直接冲洗涂片区域；
②媒染：取卢氏碘液1~2滴覆盖菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,用上法细流水冲洗；
③脱色：取95%酒精2~3滴于菌膜表面，轻微摇动，局部接近无色即可, 用上法细流水冲洗；
④复染：取1：10稀释石炭酸复红覆盖涂片区域，轻微摇动，用上法细流水冲洗；
⑤吸水纸初步吸干玻片水分，然后自然干燥；
1.2.3 镜检：于涂片区域加半滴香波油，油镜（100倍目镜）下。
1.3 实验结果
三、分离培养
1实验原理：四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养繁殖后生成个菌落。有时这些单菌落并非由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
2实验步骤
2.1示教：观察普通平板、麦康凯平板、血平板、四区分离划线平板，手机摄像。
2.2 分离划线培养：
预实验：以灭菌接种环与普通平板背面做四区分离划线；
正式试验：1以灭菌接种环取细菌少许，在普通平板上划线，划线区域约占整个平板的1/10~1/5,划线间不能有交叉现象；
2以灭菌接种环自第一区2~3个交叉，然后依次分离划线，约占整个区域的1/3~1/4；
3依上法进行3、4区分离划线；
4倒置平皿置37℃温箱培养24h，观察记录实验结果，手机摄像。
3 实验结果
四、细菌初步生化反应：
1实验原理：具有的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
2实验步骤
2.1色素试验：取滤纸条，两次对折，以折角小心取菌落少许，小心展开，观察记录，手机拍照；
2.2 氧化酶试验：取上述含菌滤纸条，滴加氧化酶试剂一滴，观察记录，手机拍照；
2.3 触酶试验：以灭菌接种环取细菌少许，置一洁净玻片表面，另设NS对照，各加一滴新制的3%H2O2, 观察记录，手机拍照；
3 实验结果
五、细菌药敏试验：
1实验原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取平板中的水分溶解后并不断先向纸片周围扩散，形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反应测试细菌对测定药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关（抑菌圈越大，MIC越小）。
2实验步骤：
2. 1以灭菌接种环取细菌少许，与普通平板做密集划线；
2.2 以无齿镊小心夹取定量药效纸片，按六边形贴于培养及表面，倒置平皿置37℃温箱培养24h，观察记录实验结果，手机拍照。
3 实验结果：
六．实验分析与讨论
1无菌操作：所有取菌种前都要将接种环灭菌，取菌时培养基也不能开太大的口，取完以后应及时盖好并放好，以防止菌种被污染。操作应当在火焰旁做。
2冷却操作：加热灭菌接种环后，应室温下冷却，否则会因高温杀死细菌。。
3接种操作时应当执笔式握接种环，轻轻触碰菌种，再接种到有生理盐水的玻片上，太少或者太多对实验都有所影响。
4染色操作：边染色边轻轻晃动以让染色剂充分覆盖菌种，冲洗时不要倾斜太大角度，不可直接对着菌落冲洗,以防把细菌冲洗下去。
5分离培养琼脂很软，划线时注意手腕用力，只在其表面划线。
6生化实验过程中细菌出现气泡说明细菌中有过氧化氢酶。用试纸取菌种注意是否取到，否则做出来是无色的。对照实验时注意菌种没有加生理盐水，而空白对照式生理盐水，触酶实验时注意及时拍照。
7药敏实验：纸片旁边出现抑菌环。贴纸片时应注意力度不要把琼脂划破。
七．实验小结
1.革兰氏染色法除了可以观察细菌形态外还可以鉴别细菌：不被酒精洗脱色保留蓝紫色的为革兰氏阳（G+），被酒精脱色复染成红色的为革兰氏阴性菌（Gˉ）可知细菌为阴性菌。本次革兰氏染色实验结果呈现为红色的棒状杆菌，细菌单个存在，染色效果非常好，实验很成功。
2.分离培养是培养单一菌种的有效方法，本次试验以小组形式呈现，每组2个平板，由于操作不熟练，细菌分布不够均匀，有部分区域细菌并未呈单个分布，培养后的·细菌形态不够漂亮，与老师相差甚远。
3.药敏试验是探究细菌在体外培养时对不同抗生素敏感性的有效试验。透明圈越大说明该药物对此细菌的抑制作用越强。
4.生化实验常用来鉴定一些形态和其他方面不易区别的微生物，是微生物分类鉴定的依据之一。触酶实验有气泡则为阳性，无气泡·则为阴性。氧化酶实验阳性变色，阴性不变色。
实验感悟
通过微生物实验的学习与操作，我认识到了微观世界的神奇与精彩，神秘而又充满危险的微生物世界让我充满了好奇感，我曾想我会为亲手将这种繁殖速度快，种类繁多，生命力顽强，无处不在的细菌，真菌培养出来而疯狂！而后我终于亲眼见证在工业微生物的课堂上培养出来的大肠杆菌！棒状的大肠杆菌充满了顽强的生命力，我为见到它而高兴！
在微生物实验过程中，我们还学习到了显微镜的用法，虽然在高中时我们便已学过显微镜的用法，但早已忘却，我用显微镜观察到了呈现红色的棒状大肠杆菌。革兰氏染色实验中我意识到了实验严谨性的重要性，取菌时需要无菌操作，只能用大拇指顶开皿盖一个小口，接种环需要用酒精灯不断高温灭菌，冷却，取菌时动作需小心，否则取到的只会是琼脂，实验宣告失败。染色也应小心谨慎，时间必须控制在30〃~40〃，否则染色效果可能不明显。
这个实验对于我们制药工程的学生来说是一次难得的体验，这对于我们以后药学实验的研究奠定了一个良好的基础，同时微生物学实验使我们的眼界开阔，让我意识到微生物制药这个前景很好的研究方向，微生物与生化药学一直广受推崇，这也是一个新新的研究方向，想从事学术研究的同学可以考虑。
微生物学老师很认真负责，这也让我们受益匪浅，王老师教会我们很多微生物学知识，同时也教会我们实验室安全知识，并且努力让我们有机会去医学院实验室学习体验这个实验。
我喜欢微生物学，也希望能有更多的机会接触其他的微生物，美丽又变化莫测的微生物界就这样走进了我的心里！
第二篇：《医学免疫学与微生物学》实验报告
《医学免疫学与微生物学》实验报告 实验一
［实验名称］：沉淀反应
［实验目的］：通过单向琼脂扩散测定待测血清Ig含量
［实验材料］：１％离子琼脂、白喉类毒素、白喉抗毒素、载玻片、毛细吸管
打孔器
［试验步骤］：（１）将溶解后的离子琼脂冷却到４５０Ｃ，加入适当浓度的抗原混合
均匀，吸取３－４毫升加在载玻片上，使其均匀布满载玻片而又
不流失。
（２）琼脂凝固后制成凝胶板，然后隔适当距离打孔。
（３）在孔内滴加待测可溶性抗体。
（４）将凝胶平板放入带盖瓷盘中，下面垫一湿纱布以保持湿度，置于
３７０Ｃ恒温箱中２４小时，观察沉淀环。
［实验结果］：（沉淀环直径）
测量沉淀环直径： 。
［实验分析］ 单向琼脂扩散是一种定量试验，主要用来测定标本中各种免疫球蛋
白或补体成分的含量。
在孔中加入待测抗体使其向四周扩散，经一定时间后抗体与琼脂中
抗原相遇，在比例适宜处生成白色沉淀环。
沉淀环直径与抗体浓度成正比。根据测试样品沉淀环直径的大小，
可从已知的标准曲线中查出样品中抗体的含量。
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《医学免疫学与微生物学》实验报告 实验二
［实验名称］：间接凝集抑制试验（妊娠试验）
［实验目的］：测定待检尿液中是否含ＨＣＧ（绒毛膜促性腺激素）以诊断妊娠
［实验材料］：孕妇尿液、非孕妇尿液、ＨＣＧ致敏乳胶抗原、抗ＨＣＧ血清、载玻
片等
［试验步骤］：
（１）取一片载玻片，标记出左右。
（２）在载玻片左侧加一滴待检尿液，右侧加一滴非孕妇尿液。
（３）在两侧尿液中分别加一滴抗ＨＣＧ血清，摇动混匀２－３分钟。
（４）在两侧液滴中分别再加一滴ＨＣＧ致敏乳胶抗原，摇动混匀２－３分钟。 （５）观察判定结果。
［实验结果］： （凝集和非凝集的描述）
左侧（待检尿液侧）呈现均匀的乳状液状态，无凝集颗粒。间接凝集抑制阳性。右测（非孕妇尿液侧）出现明显的凝集颗粒。间接凝集抑制阴性。
［实验分析］： （结合实验原理）
孕妇尿液中的ＨＣＧ含量显著增高。尿液中的ＨＣＧ与加入的抗ＨＣＧ结合，抗ＨＣＧ被消耗，使得加入的ＨＣＧ乳胶抗原不能再与抗ＨＣＧ结合，不出现乳胶抗原间接凝集反应（凝集被抑制），所以液滴呈现均匀乳状液，为乳胶间接凝集抑制阳性反应。
非孕妇尿液中ＨＣＧ含量极少，不足以抑制抗ＨＣＧ与ＨＣＧ乳胶抗原发生间接凝集反应，所以出现乳胶颗粒的凝集，为乳胶间接凝集抑制阴性反应。
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《医学免疫学与微生物学》实验报告 实验三
［实验名称］： 细菌形态、特殊结构观察及显微镜油镜头使用
［实验目的］： 认识细菌的基本形态和特殊结构，学会使用显微镜油镜头
［实验材料］： 显微镜、香柏油、二甲苯、镜头纸、球菌标本片、杆菌标本片、弧菌
标本片、荚膜标本片、芽孢标本片、鞭毛标本片
［试验步骤］：
（一）显微镜油镜头的使用
１、用油镜观察时光线宜强，可将聚光器升高，开大光圈。
２、在标本片上滴加一滴香柏油。
３、眼睛从镜筒侧面观察，同时缓慢将镜筒调至镜头浸入香柏油中（勿接触标本片）。 ４、眼睛移至目镜。先用粗调焦螺旋缓慢将油镜调离标本玻片直至观察到模糊物象，
再用细调焦螺旋调至物象清晰。观察。
５、观察完毕后把油镜头擦拭干净，显微镜复位收好。
（二）细菌基本形态的观察
（三）细菌特殊结构的观察（示教）
［实验结果］：（绘图）根据观察结果绘制细菌基本形态、特殊结构图（不少于两幅） ［实验分析］： （结合结构的功能）
１、细菌的基本形态有球形、球杆形、杆形、弧形、螺旋形五种形态。
２、某些细菌在生长繁殖时，可分泌一些粘液性物质包绕在细胞壁外围，称为荚膜，
用特殊染色法可将荚膜染成与菌体不同的颜色。荚膜具有抗原性，可以鉴别细菌或细菌分型；细菌的荚膜与其致病性有关。
３、某些细菌由细胞质伸出的细长弯曲的蛋白质丝状物，称为鞭毛。鞭毛是细菌的
运动器官，鞭毛具有较强的抗原性，有些细菌的鞭毛与其致病性有关。
４、某些Ｇ－的菌体上有比鞭毛细、短而直、数量多的丝状物，称为菌毛，主要成分
是蛋白质。菌毛分普通菌毛（与细菌致病力有关）和性菌毛（传递遗传物质、使第3页共6页
《医学免疫学与微生物学》实验报告 受体菌获得某些相应性状）
５、某些Ｇ＋在体内外营养物质缺乏的环境下，细胞浆发生脱水浓缩，在菌体内形成
一个折光性强、通透性低的圆形或椭圆形小体，称为芽孢。用特殊染色法可将芽孢染成与菌体不同的颜色。芽孢的大小、形态和位置随菌种不同而有差异，有助于细菌的鉴别；芽孢对热、干燥、化学消毒剂和辐射都有较强的抵抗力。
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《医学免疫学与微生物学》实验报告
实验四
［实验名称］： 细菌人工培养性状观察及革兰氏染色法
［实验目的］： 观察细菌菌落形态、溶血现象、色素；细菌标本的涂片和革兰氏染色
法检查
［实验材料］： 细菌人工培养性状观察示教片、大肠杆菌菌落、葡萄球菌菌落、载玻
片、生理盐水、接种环、酒精灯、结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%酒
精、复红染液、显微镜等
［试验步骤］：
（一）细菌菌落形态、溶血现象、色素等观察（示教）
（二）细菌标本的涂片
１、取两张洁净的载玻片，分别滴加一滴生理盐水。
２、以无菌操作法，用接种环分别挑取少许大肠杆菌菌落和葡萄球菌菌落，分别涂
于两张载玻片的生理盐水中研成均匀混浊的菌膜（不可过厚）后自然干燥。 ３、将干燥后的标本片在酒精灯的火焰上方快速通过三次，予以固定。
（三）染色 将制好的标本片按下列步骤进行染色
１、在两片标本片上分别滴加结晶紫染液初染１分钟，水洗。
２、滴加卢戈氏碘液媒染１分钟，水洗。
３、滴加９５％酒精，摇动载片０．５－１分钟脱色至恰无紫色退下，水洗。 ４、滴加稀释复红染液，复染０．５－１分钟，水洗，干燥。
５、镜检。葡萄球菌（Ｇ＋球菌）染成紫色，大肠杆菌（Ｇ－菌）染成红色。
［实验结果］： （描述不同细菌菌落的区别，绘图表示革兰氏染色的镜下结果） １、液体培养基中：葡萄球菌呈均匀混浊生长，链球菌呈沉淀生长，枯草杆菌形成菌
膜；在普通琼脂平板上：金黄色葡萄球菌产生脂溶性金黄色色素使菌落呈现金黄色但培养基颜色不变，绿脓杆菌产生水溶性色素使培养基呈现绿色；在血琼脂平第5页共6页
《医学免疫学与微生物学》实验报告 板上：金黄色葡萄球菌菌落周围形成透明的溶血环，甲型溶血性链球菌菌落周围形成狭窄的草绿色溶血环，乙型溶血性链球菌菌落周围形成宽而透明的溶血环。 ２、绘图表示大肠杆菌、葡萄球菌经革兰氏染色后的镜检结果
［实验分析］： （结合细菌细胞壁构造分析革兰氏染色法结果及意义）
结果：
Ｇ＋菌的细胞壁由肽聚糖（三维空间结构）和磷壁酸组成，在酒精作用下通透性降低，而且Ｇ＋菌的等电点较低，带负电荷多，结合碱性染料多，因此结晶紫与碘的复合物不易被酒精脱除被染成紫色。
Ｇ－菌的细胞壁由肽聚糖（疏松薄弱的二维结构）、脂蛋白、外膜、脂多糖等成分组成，在酒精作用下通透性增高，而且Ｇ－菌的等电点较高，结合碱性染料较少，因此初染的结晶紫被酒精脱色而被复红复染成红色。
意义：
１、鉴定细菌 ２、指导临床选择药物 ３、研究和了解细菌的致病性 第6页共6页