山东大学实验报告 2012年 12 月 4日
姓名 系年级 20##级生科2班 组别 四
科目 微生物学实验 题目 微生物的生理生化反应
微生物的生理生化反应
一、【实验目的】
1. 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。
4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
5. 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。
二、【实验仪器与试剂】
菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌
培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄糖蛋白胨水培养基；
试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、
仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管
三、【实验原理】
1.在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
2.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。
3.油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说明此中菌可产生分解油脂的酶。
4. 糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。
5.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。
（1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测
的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色转变为红色，即甲基红反应。大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
四、【实验步骤】
1. 淀粉水解实验
（1）倒平板：按照淀粉培养基配方配制固体淀粉培养基，灭菌，待培养基冷却至50℃左右，在酒精灯火焰旁倒平板，每组两个平板。
（2）用记号笔在平板底部划成四部分。
（3）接种：在无菌操作台上，将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在不同的部分点种，如图一所示，注意仅用接种针接触极少面积的培养基，在平板的反面对应部分贴上标签，标签上分别写上菌名，以免混淆。
（4）培养：将平板倒置，在28℃温箱中培养两天。
（5）观察：取出培养基，观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，观察培养皿中菌落周围是否有无色透明圈，若有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，为阳性，反之则为阴性。记录实验结果。
图一：淀粉水解试验接种示意图 图二：油脂水解试验接种示意图
2.油脂水解试验
（1）倒平板：按照油脂培养基配方配制固体油脂培养基，灭菌，待培养基冷却至50℃左右，充分振荡，使油脂均匀分布，在酒精灯火焰下倒平板，每组两个平板。
（2）用记号笔在在平板底部划成四部分。
（3）接种：在无菌操作台上将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别划十字线接种于平板相对应部分的中心，如图二所示，并贴好标签，标签上注明菌种的名称。
（4）培养：将平板倒置，在28℃温箱中培养两天。
（5）观察：取出平板，观察菌苔颜色，如果出现红斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。记录实验结果。
3.葡萄糖发酵实验
（1）培养基的配制：按照糖发酵培养基配置葡萄糖发酵培养基，分装至试管中，用胶头滴管往德汉氏小管中注满培养基，再把德汉氏小管倒置放入试管中，注意不要让德汉氏小管中进入空气，每组五只试管，灭菌。
（2）接种：待培养基冷却至常温时，在无菌操作台上，取葡萄糖发酵培养基试管2支接入大肠杆菌，
再取两只接入普通变形杆菌，接种后轻摇试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡，第五支不接种，作为对照。在各试管外壁上贴上标签，标签上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。
（3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于28℃下培养两天。
（4）观察：观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，并记录实验结果。
4.乳糖发酵实验
（1）培养基的配制：按照糖发酵培养基配置乳糖发酵培养基，分装至试管中，用胶头滴管往德汉氏小管中注满培养基，再把德汉氏小管倒置放入试管中，注意不要让德汉氏小管中进入空气，每组五只试管，灭菌。
（2）接种：待培养基冷却至常温时，在无菌操作台上，取乳糖发酵培养基试管2支接入大肠杆菌，再取两只接入普通变形杆菌，接种后轻摇试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡第五支不接种，作为对照。在各试管外壁上贴上标签，标签上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。
（3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于28℃下培养两天。
（4）观察：观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，并记录实验结果。
5.吲哚试验
（1）培养基的配制：按照蛋白胨水培养基配方配制培养基，分装至试管中，每组五只试管，在高压蒸气锅内灭菌。
（2）接种：待培养基冷却后，在无菌操作台上将大肠杆菌接入2支蛋白胨水培养基，产气肠杆菌接入2支蛋白胨水培养基，剩余一只试管不接种，作为空白对照，贴好标签。
（3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于28℃下培养两天。
（4）观察：往培养后的蛋白胨水培养基内加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管避徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。观察加入试剂后试管内的颜色反应并记录实验结果。
6.甲基红试验
（1）培养基的配制：按照葡萄糖蛋白胨水培养基配方配制培养基，分装至试管中，每组五只试管，在高压蒸气锅内灭菌。
（2）接种：待培养基冷却后，在无菌操作台上将大肠杆菌接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基，产气肠杆菌接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基，剩余一只试管不接种，作为空白对照，贴好标签。
（3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于28℃下培养两天。
（4）观察：培养两天后后，将每支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入2滴甲基红试剂，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。观察试管内的颜色变化，并记录实验结果。
五、【实验结果及分析】
实验结果记录
淀粉水解试验:
表1.淀粉水解试验结果(“+”表示阳性，“—”表示阴性)
油脂水解试验:
表2. 油脂水解试验结果(“+”表示阳性，“—”表示阴性)
葡萄糖发酵培养基：
表3. 葡萄糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
乳糖发酵培养基:
表4. 乳糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
吲哚试验:
表5.吲哚试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
甲基红试验:
表6. 甲基红试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
六、【注意事项】
1.淀粉水解试验中，观察各种细菌生长情况时，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，应轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。
2.油脂水解试验中，制备固体油脂培养基时，应充分摇荡，使油脂均匀分布。
3.接种前要用记号笔做好标记，接种时要对号接种，以免接错菌种，造成混乱。
4.糖发酵试验中，接种后要轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。否则会造成假象，得出错误的结果。
5.吲哚试验中，注意加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，再沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。否则就会观察不到在乙醚和培养物之间产生的红色环状物。
6.甲基红试验中，应该注意甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性。
7.在使用酒精灯时要特别注意，避免酒精灯爆炸。
8. 接种均在无菌条件下操作，接种完毕以后用灭菌好的棉花塞住管口防止污染。
七、【思考题】
1. 你怎么样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？
答：淀粉是大分子物质，进入细胞十分困难，甚至需要触及高耗能的胞吞作用。因而通过胞外酶的作用，将淀粉水解为葡萄糖后运入细胞，较方便高效。试验中菌苔周围出现透明圈，说明培养基内淀粉被水解，可推测是细菌细菌将淀粉酶分泌到胞外所致，因此为胞外酶。
2. 不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？
答：淀粉水解为葡萄糖才能被细胞利用，因此可以换用斐林试剂。呈阳性者则说明产生了葡萄糖，淀粉被水解；阴性者说明淀粉未被水解。
3. 假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？
答：由于产生的CO2溶于水的量少且碳酸酸性若，因此颜色不变化，仍为紫色。德汉氏小管中有气柱。
4. 讨论IMViC试验在医学检验上的意义。
答：可以鉴别某些疾病是由大肠杆菌还是产气肠杆菌引起的。
5. 解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？
答：有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。 因为丙酮酸是生物体呼吸作用的产物，无论是有氧还是无氧，都会产生丙酮酸，因而无法作为色氨酸酶活性的指示剂进行区分。 同时吲哚能通过有明显颜色变化的化学反应观测到，而丙酮酸不能，所以试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸。
6.为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性？
当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（PH6.3）转变为红色（PH4.2），即甲基红反应。而大肠杆菌和产气肠杆菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养的后期仍能维持酸性PH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大约6。因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
八、【实验总结】
各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础，例如，一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物。另一方面，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用。本实验是通过细菌对大分子物质的水解试验、糖发酵试验、鉴定肠道菌的其他不同生化反应等几个实验，来证明不同的细菌其生化功能的多样性和微生物之间的互相作用。
附： 淀粉培养基配方
蛋白胨·············································································· 10g
NaCl···················································································· 5g
牛肉膏················································································ 5g
可溶性淀粉········································································· 2g
蒸馏水········································································ 1000mL
琼脂··········································································· 15～20g
pH·················································· 自然
油脂培养基配方
蛋白胨·············································································· 10g
NaCl···················································································· 5g
牛肉膏················································································ 5g
花生油·············································································· 10g
1.6%中性红水溶液···························································· 1mL
琼脂··········································································· 15～20g
蒸馏水········································································ 1000mL
PH····················································································· 7.2
葡萄糖（乳糖）发酵培养基配方
蛋白胨水培养基·························································· 1000mL
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液··············································· 1～2 mL
PH····················································································· 7.6
20%葡萄糖（乳糖）溶液················································· 10mL
蛋白胨水培养基配方
蛋白胨·············································································· 10g
NaCl···················································································· 5g
蒸馏水········································································ 1000mL
PH····················································································· 7.6
葡萄糖蛋白胨水培养基
蛋白胨················································································ 5g
葡萄糖················································································ 5g
K2HPO4······································································································· 2g
蒸馏水········································································ 1000mL
PH················································································· 7.0-72