第一部分 微生物学实验基本技能培训
第一次实验（4学时，2人/组）
绪 言
介绍本课程的教学大纲、实验指导书、实验要求和考核方法；
介绍本学期《微生物学实验》课程的内容安排和时间安排。
介绍微生物实验室须知事项，注意生物安全、水电防火安全等。
介绍实验预习报告与实验报告的统一格式和要求。
实验预习报告：
标题
目的要求
原理
实验器材
操作步骤（含注意事项）
预期结果
实验报告：
标题
实验器材
实验程序与操作要点
结果
讨论与体会
思考题
考核：
评分比例：平时考核占60%，期末考核占40%。
平时考核内容包括预习报告、实验操作及实验报告（各占20%， 40%， 40%。）
平时考核登记 A+：95，A：90，B+：85，B：80，C+：75，C：70，D+：65，D：60，E：≤50
实验一 培养基的配制与无菌器材的准备（9月27日）
一、目的要求
1、明确培养基的配制原理。
2、通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
3、了解灭菌的常用方法及应用对象。
4、学习高压蒸汽灭菌锅的操作方法及注意事项。
5、学习干热灭菌的操作技术。
6、了解分离培养微生物前的有关准备工作。
二、基本原理
培养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，它是进行科学研究，生产微生物制品及应用等方面的基础。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多，要根据培养目的和检测需要不同，选择配制不同的培养基。
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。适用于一般培养基、玻璃器皿、无菌水、金属用具。一般培养基在121．3℃灭菌20分钟即可。
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160—170℃），时间长（1—2小时）。但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烤焦，甚至引起燃烧，因而一般塑料制品不能用干热灭菌。
三、实验器材
1、试剂
牛肉膏、蛋白胨，氯化钠，琼脂，1mol/L NaOH，1mol/L HCl等。
2、仪器和其他用具
试管，三角瓶，烧杯，量筒，培养皿，玻棒，涂布棒，培养基分装器，天平，药勺，高压蒸汽灭菌锅，pH计，pH试纸等。
四、实验操作步骤
（一）、培养基的配制
称量 -熔化- 调pH -过滤-分装 - 加塞 - 包扎标记 - 灭菌 - 搁置斜面或倒平板 - 无菌检查
配方：牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g，氯化钠5.0g，水1000ml，pH7.4-7.6。
固体培养基一般加琼脂15-20g。
1、牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备（以每组300ml计）
（1）称量：除琼脂外，按培养基配方比例依次准确地称取药品，放入搪瓷杯中。蛋白胨极易吸水，称量时动作要快。
（2）熔化：量取蒸馏水，加入所需水量的一部分至上述搪瓷杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。
（3）调pH：待培养基稍冷却后，用精密pH试纸测量培养基的原始pH，若偏酸，用1mol/L NaOH边滴加边搅拌，使之达到pH7.4-7.6。若偏碱，则用1mol/L HCl调节。
（4）过滤：趁热过滤。如无特殊要求，可省略。
（5）分装：用分装装置将培养基装入试管，高度为试管总长的1/5，每组分装6支试管。余下培养基转入三角瓶中，培养基的量为三角瓶容量的1/3-1/2。
在漏斗下口处套有一段透明胶管，胶管下部用弹簧夹夹紧。分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。
（6）加塞：试管加棉花塞（或泡沫塑料塞、试管帽），三角瓶加棉塞或泡沫塑料塞。
棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与拇指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞做成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。
（7）包扎标记：6支试管扎成一捆，棉塞外加一层牛皮纸防灭菌时冷凝水湿润棉塞，在外用绳扎成活结。三角瓶棉塞外加盖牛皮纸，用绳扎成活结。用记号笔注明培养基名称、班级、组别、配制日期。
（8）灭菌：0.1MPa，121℃，20min高压蒸汽灭菌。见实验流程（三）。
（9）搁置斜面：待已灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁置在有合适高度的器具上，使培养基斜面长度不超过试管总长的一半为宜。
（10）倒平板：待三角瓶中培养基冷却至50℃左右，倒平板。备用。
（11）无菌检查：灭菌培养基放入37℃培养箱中24-48小时，若无细菌污染则说明灭菌彻底。
2、牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备（600-800ml/班，由2组同学或教师完成）——老师代
按培养基配方比例依次准确地称取药品，除琼脂外，方法同固体培养基的制备过程。
各组需完成：用分装装置将培养液分装到试管中，高度为试管长度的1/4。每组6支试管，自行分装、包扎、灭菌。
（二）、准备无菌器材
1、培养皿：洗净的培养皿烘干后，每组将10-12套培养皿叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，然后进行灭菌。
2、移液管：洗净、烘干后的吸管，在吸口的一头塞入少许脱脂棉花，以防在使用时造成污染。塞入的棉花量要适宜，多余的棉花可用酒精灯火焰烧掉。每支吸管用一条宽约4~5cm的纸条，以30~50℃的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，标上容量，若干支吸管包扎成一束进行灭菌。
每组1ml移液管5-6支、10ml移液管1支
3、试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞。每组捆扎加塞试管4-5支，每组用三角烧瓶装入不超过三角瓶容积1/2的去离子水。
4、玻璃涂布棒：1支用报纸包好。
上述物品用记号笔注明班级、组别、日期。
（三）、灭菌操作步骤
1、高压蒸汽灭菌
（1）关好排水阀门，放入蒸馏水至标度。注意水量一定要加足，否则容易造成事故。
（2）将须要灭菌的器材、培养基等装入灭菌锅中，加盖密封。旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度（不要太紧），然后再旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目的。
（3）通电加温，打开排气阀门，排尽锅内的空气。全自动高压锅应关闭排气阀，
（4）恒温灭菌: 0.1MPa 或15磅压力（锅内温度相当于120℃～121℃）保持20～30分钟。
（5）降温：自然降温，当锅内蒸汽完全排尽时即压力表指针降到零时，才能打开排气阀。
（6）取出灭菌物品：如培养基需制备固体斜面培养基时，则应趁热将试管斜放在桌上。
培养基、无菌水等：湿热灭菌。
2、干热灭菌
（1）将包扎好的玻璃器皿摆入电热烘箱中，相互间要留有一定的空隙，以便空气流通。
（2）关紧箱门，打开排气孔，接上电源。
（3）待箱内空气排出到一定程度时，关闭上排气孔，加热至灭菌温度后，固定温度进行灭菌：150～170℃灭菌1.5～2h。2小时后切断电源。
（4）待烘箱内温度自然降温冷却到60℃以下后，再开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。
放入烘箱加热灭菌：150～170℃灭菌1.5～2h。
玻璃器皿：可选择干热灭菌或湿热灭菌
五、注意事项
1、培养基的配制
加热熔化过程中，要不断搅拌，以免琼脂或其它固体物质粘在烧杯底上烧焦。加热过程中所蒸发的水分应补足； pH值必须按不同培养基要求准确测定；所有器皿要清洁，忌用钢质、铁质器皿；分装培养基时，注意不使培养基沾在瓶口或管壁上端以免浸湿棉塞，引起杂菌污染；培养基灭菌的时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以达到灭菌效果且不损害必要营养成分；灭菌后的培养基须放37℃温箱内培养24h，无菌生长时方可使用。
2、灭菌
使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故，如锅内应加足水份，以防干烧；灭菌时，操作者切勿擅自离开；务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。
干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触，以防包装纸烤焦起火。待烘箱内温度自然降温冷却到60℃以下后，再开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。
六、思考题
1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查培养基灭菌是否彻底？
2、高压蒸汽灭菌开始前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降至0时才能打开排气阀，开盖取物？
七、讲授重点
1、培养基种类、配制培养基的基本原理与方法。
2、高压蒸汽灭菌和干热灭菌的原理和规范操作流程。
八、实验要求
每组需完成制作棉塞、配制培养基、准备无菌器材
九、考核点
操作是否规范、迅速
第二次实验（4学时，1人/组）
实验二 微生物的分离、接种及环境微生物的检测（9月28日）
一、目的要求
1、体会无菌操作技术在微生物研究中的重要性。
2、证实环境中存在微生物。
3、掌握倒平板的方法。
4、学习微生物接种的基本技术。
5、学习分离微生物的常用方法。
二、基本原理
高温对微生物具有致死效应，在微生物接种时，一般在酒精灯旁进行，用火焰直接灼烧接种环，以达到灭菌的目的。
自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法常用的有：稀释涂布平板法、稀释混合平板法与平板划线法。不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌（Saphylococcus aureus）斜面培养物。
2、培养基
牛肉膏蛋白胨固体和液体培养基。
3、仪器和其他用具
接种环、酒精灯、试管架、记号笔、培养皿、恒温培养箱等。
四、实验步骤
1、微生物接种技术
（1）试管斜面接种法（用接种环转接菌种）：
标记：用记号笔对待接试管斜面培养基进行标记，写上待接菌种名称、接种日期、组别。
取菌：左手拿大肠杆菌试管斜面培养物，右手持接种环，将接种环在火焰上进行灼烧灭菌，然后在火焰旁用右手小指指和无名指或右手掌缘拔出并夹住试管棉塞，试管口在火焰上烧一下。接种环轻轻插入斜面上半部，在管壁冷却水上或管壁上使接种环冷后，挑起少许菌苔，再烧一下试管口，塞上棉塞，左手把斜面试管放回试管架。右手持有菌接种环在酒精灯旁无菌区。
接种：左手从试管架上取出标记好的斜面试管一支，右手掌缘拔出棉塞，试管口在酒精灯上灼烧一下，沾有菌苔的接种环迅速放进斜面底部，从下到上划一直线，然后再从底部开始向上作蛇形划线接种。完毕后，烧一下试管口，塞上棉塞，接种环在火焰上灼烧后放回原处。
培养：试管放37℃培养箱中培养24-36小时。
（2）液体培养基接种法：
接种流程同（1）。接种时略有不同，即将挑有菌苔的接种环在液体表面的管内壁上轻轻摩擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基中。轻轻摇匀培养液。
2、平板分离技术
（1）稀释涂布平板法：
倒平板：灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基冷却到55℃左右，摇匀。解开麻绳，去掉三角瓶口上的牛皮纸和纱布，右手持装培养基的三角瓶在酒灯旁，瓶口对着火焰。左手持9cm无菌培养皿并将皿盖在火焰旁打开一条缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，平置于桌面上，使培养基均匀分布于皿底，待冷凝后即为平板。
菌液稀释：取4支无菌试管，每管加9 ml无菌水，无菌操作取1ml大肠杆菌菌液至9ml无菌水中混匀，依次进行10倍稀释。
涂布：取0.1ml稀释菌液入平板中，用无菌涂布棒在培养基表面涂布均匀。
培养：合上皿盖，倒置培养皿于37℃培养24-36小时。
挑菌落：挑取单个菌落的菌苔少许，涂在载玻片上进行显微镜个体形态观察，结合菌落形态特征综合分析。若不纯，需再用平板分离法进行纯化。
（2）平板划线法：
倒平板、培养和挑单菌落同A。
划线：左手拿平板，右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取菌液或菌苔一环，在平板上划平行线三条，接种环在火焰上灭菌，左手转动平皿约70度，用无菌接种环通过第一次划线的末端作为起点作二次划线，依次作第三次、第四次划线（平行线划线法）。或将挑取有菌的接种环在平板培养基上作连续划线。
3、环境微生物的检验
将1个牛肉膏蛋白胨平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基暴露在空气中，将另一牛肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。10min后盖上两个皿盖。
五、注意事项
1、无菌技术
手和台面要消毒；
无菌操作需在火焰旁进行，手不可触摸试管口端，以防烫伤；
接种时接种环不要碰触试管口边，防止污染；
棉塞不可放在桌面上，应该用右手手缘或右手指间夹住。
2、平板分离技术
倒平板时，培养皿边缘不要沾染培养基，摇匀培养基时要轻，以防培养液溅到皿盖或溢出培养皿；
划线接种时，动作要轻，注意不要划破培养基；
分离、接种时应严格按无菌操作要求进行；
平板培养微生物时要倒置培养。
六、实验结果
1、记录液体培养基和固体斜面培养基上，细菌的生长状况。
2、记录菌种分离培养的结果。
七、思考题
1、平板培养时为什么要把培养皿倒置？
2、在划线分离时，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？
八、讲授重点
1、倒平板
2、微生物转接方法
3、平板划线法和涂布平板法
九、实验要求
每位学生练习倒平板、液体试管接种、斜面接种、平板划线和涂布平板。
十、考核点
1、无菌操作是否规范
2、平板划线方法是否正确
实验三 显微镜的基本知识及使用方法
附：数码显微镜的使用
一、目的要求
1、掌握普通光学显微镜的构造及各部分的功能。
2、学习并掌握油镜的原理、使用方法、维护的基本知识。
3、掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能。
4、学习显微数码系统的使用方法。
5、了解微生物在显微镜下的基本形态特征。
二、基本原理
现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成，在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率，而在普通光学显微镜通常配制的几种物镜中，油镜的放大倍数最高，但需要在载波片与镜头之间加滴镜油，主要是为了增加照明亮度和提高显微镜的分辨率。
物镜放大倍数越大，焦距越短，直径更小，所需光强越大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同，会发生折射或全反射使光线不能进入镜头。结果导致物像不清。在油镜和玻片间滴加与玻璃折射率（空气是1.55，香柏油是1.52）相近的镜油，使光线不会造成太大的损失。
显微镜分辩率是显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力，最小距离越小，分辨率越高。分辩率=λ/2NA=λ/2n·sin（α/2） 公式中λ可见光波长，平均为0.55μm，n折射率(香柏油1.52，空气1.0，水1.33)，NA是物镜的数值孔径，取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率。
三、实验器材
1、标本片：霉菌标本片、细菌（枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis等）的标本片（2片/组）。
2、溶液和试剂：香柏油、乙醇乙醚混合液或二甲苯等（各一瓶/组）。
3、仪器或其他用具：普通光学显微镜（1台/组）、擦镜纸。
四、实验步骤
（一）显微镜操作
演示与录相
1、观察前准备：镜座距实验台边缘约10cm，光源调节，调节目镜、调节聚光器数值孔径值。
2、显微镜观察：
（1）低倍镜观察
（2）高倍镜观察
（3）油镜观察
一种方法是先低倍再高倍再油镜，使用微调节器聚焦。第二种方法是在低倍下找到样品区，用粗调节器升高镜筒，将油镜转到工作位置，在样品区滴加镜油后，从侧面注视用粗调节器小心降下镜筒，并使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，调节聚光器的数值孔径及视野照明亮度后，用粗调节器将镜筒徐徐上升，再用细调节器使聚焦清晰为止。后一种方法尽量不用，在实验中重点介绍和使用第一种方法。
3、 显微镜用毕后的处理：上升镜筒，取下载玻片；擦净镜油；清洁物镜及目镜；还原各部件，降下聚光镜。
（二）Motic显微数码系统的使用
演示与录相
建文件夹： 例如 D:\20##-20##学年\环境0511班姓名
图片要求：
1）格式：JPG
2）文件名：例如 环境0511班 姓名 大肠杆菌1000倍
五、注意事项
1、显微镜是精密仪器，在取放时要一手托住底座，一手握住镜臂，忌用单手拎提。
2、养成双目观察的习惯，忌单眼观察。
3、观察时可摘下近视镜或远视镜，因显微镜具有聚焦校正功能。若在观察时配载眼镜，应防止眼镜镜片与目镜镜片接触，以免造成镜片划痕。
4、显微镜照明亮度的调节，可通过升降聚光器或改变光源亮度进行调节，一般情况下聚光器都是调到最高位置。只要能获得良好的观察效果，也可以通过对虹彩光圈、聚光器高度、照明光源强度的协同调节灵活运用。
5、使用粗节器聚焦物像时，必须养成的习惯是：先从侧面注视并小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本。否则可能因误操作而损坏镜头及玻片。
6、一般情况下，可利用同焦现象，对在低倍镜下看到的物像，可以转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置，然后用细调节器对物像进行清晰聚焦，可以避免因使用粗调节器时可能发生的误操作而损害镜头或玻片。
7、使用乙醇乙醚混和物或二甲苯等清洁剂时，不要过量使用或让其在镜头上停留时间过长，因清洁剂对镜头会造成损害。不能用手或滤纸擦镜头，以免污染镜头或产生划痕。
8．注意区分待观察样品与使用时间较长的显微镜镜头上的霉点等污物。
9．每人在D盘上建一个文件夹，文件夹名与文件名的要求。
六、实验结果
低倍、高倍、油镜下观察微生物形态图
七、思考题
1、用油镜观察时应注意哪些问题？
2、在载玻片和镜头之间滴加香柏油有什么作用？
八、讲授重点
1、 显微镜结构
2、油镜工作原理
3、如何使用双目清晰观察物像
4、聚光器数值孔径的调节
5、利用物镜的同焦现象，如何配合使用低倍镜、高倍镜和油镜分别在不同物镜下获得清晰图像。
6、使用注意事项，特别是油镜。
7、数码显微镜系统软件的使用。
九、实验要求
1、练习使用显微镜，每位同学至少观察微生物的2个标本片（低倍、高倍物镜下观察霉菌，在低倍、高倍物镜、油镜下观察细菌），每一类型的微生物至少观察一个标本片。
2、用数码显微系统分别拍摄所观察到的微生物形态图，提交2张图片（高倍物镜下观察霉菌和油镜下观察细菌）。
3、制成图版打印黑白图片，并标注菌种名称、观察物镜及总放大倍数。
十、考核点
操作是否规范熟练以及油镜下的物像清晰度
第三次实验（4学时，1人/组）
微生物标本的制备与染色
实验四 细菌的简单染色法
一、目的要求
1、学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。
2、学习无菌操作技术。
3、进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术。
4、初步认识细菌的形态特征。
二、基本原理
细菌制片常采用涂片法，通过涂沫能使细菌细胞个体均匀分散在载玻片上，有利于观察个体形态。加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，能杀死大多数细菌但不会破坏细胞形态。
微生物染色的基本原理是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透和吸附作用等。化学因素：主要是正负离子之间的相互吸引。染色剂按染料电离后所在地带电荷的性质分为几种类型：酸性染料（如酸性复红，刚果红，伊红和苯胺黑等）、碱性染料（碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰等，细菌易被这种染料染色）、中性（复合）染性（伊红，美兰，Gimsa染料）。
简单染色法是利用单一染料（如吕氏美蓝、碱性品红）对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，碱性染料电离时的染色部分带正电荷，因此，碱性染料的染色部分容易与细菌结合使细菌着色。在显微镜下因与背景有明显对比而易于识别。
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌（Saphylococcus aureus）斜面培养物。
2、 染色剂：碱性美蓝染液，石炭酸复红染液。
3、仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，镊子、接种环、载玻片夹子、滤纸等。
四、实验步骤
涂片- 干燥 - 固定 – 染色 – 水洗 – 干燥 - 镜检
1、涂片：取干净载玻片，用记号笔做好标记，滴一滴生理盐水于载玻片中央；用接种环无菌操作分别挑取适量菌苔，沾有菌苔的接种环在载玻片上的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜（如果用液体培养物，则用接种环蘸取1-2环菌液直接涂沫于载玻片上）。
2、干燥：自然风干或用电吹风干燥。
3、固定：细菌涂面朝上，通过火焰2-3次。
4、染色：载玻片平放于桌面或载玻片支架上，滴加染液使之覆盖菌膜，一般染色1-2分钟。
5、水洗：倾去染液，用自来水冲洗，水流宜缓，否则易冲掉细菌涂膜，至洗出的水无色为止。
6、干燥：用吸水纸吸去多余水分，自然风干。
7、镜检：制好的样片在显微镜下观察并记录。
五、注意事项
1、涂片时取菌量要适量，且要求涂布均匀。
2、无菌操作取菌时一定要等接种环冷却后再取菌，以免高温使菌体变形。
3、涂片需干燥后再加热固定，避免加热时间过长引起细胞易破裂或变形，以至载玻片破裂。加热固定时要用载玻片夹子或镊子，以免烫伤。
4、使用染料时注意避免沾到衣物和实验台面上。
六、实验结果
低倍、高倍、油镜下观察细菌形态图
七、思考题
在进行细菌涂片时应注意哪些环节？为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？
八、讲授重点
1、 细菌简单染色的原理。
2、 无菌操作与细菌涂片操作要点。
3、 染色剂的类型与常用种类。
4、 显微镜的使用。
九、实验要求
每位学生至少用一种染色剂对一株菌进行染色、观察、拍照。提交1张在油镜下观察到的细菌形态图，标明菌种名称和总放大倍数。
十、考核点
涂片质量与油镜下图像的清晰度
实验五 细菌革兰氏染色法
一、目的要求
1、 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
2、 掌握革兰氏染色法操作技术。
二、基本原理
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的，当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，通透性降低，从而使结晶紫－碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫－碘的复合物比较容易洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色是细菌分类的重要依据之一。
三、实验器材
1、菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Saphylococcus aureus）等细菌16-18h斜面培养物。
2、 染色剂：石炭酸复红染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇。
3、仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，镊子、接种环、载玻片夹子、滤纸等。
四、实验步骤
制片 - 初染 - 媒染 - 脱色- 复染 - 镜检
1、制片：与细菌简单染色法的涂片、干燥和固定过程相同。
2、初染：滴加结晶紫染色液于菌膜上1-2分钟，流水冲洗。
3、媒染：卢戈氏碘液冲洗一下菌膜，再滴加该液于菌膜上，静置1分钟。
4、脱色：95%酒精冲洗至无色后，再水洗。
5、复染：番红染色液覆盖菌膜，静置2分钟后水洗，干燥。
6、镜检：显微镜观察。
7、三区涂片染色：在熟悉上述革兰氏染色过程后，在同一载玻片上分别用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（或金黄色葡萄球菌）单独涂片及二者的混合涂片，染色、镜检比较观察。
五、实验注意事项
1、实验三、四中的注意事项同样适用于本实验。
2、选取活跃生长期菌种、涂片厚度适宜、脱色程度适当，能避免产生假性革兰氏染色结果。
六、实验结果
1、拍摄油镜下观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌与大肠杆菌的单菌涂片及混合涂片的革兰氏染色菌体图。
2、将实验结果填于表3-1。
表3-1 革兰氏染色结果记录表
七、思考题
1、哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
2、现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是阴性，如何确定你的染色结果的正确性？
八、讲授重点
1、 细菌革兰氏染色的原理。
2、 革兰氏染色操作要点和结果判断。
九、实验要求
每位同学完成2个单菌涂片及1个三区涂片，进行染色、观察、拍照。记录革兰氏染色结果。提交3张在油镜下观察到的细菌形态图，标明菌种名称和总放大倍数。
十、考核点
1、无菌操作是否规范
2、染色过程操作是否规范
3、显微镜操作是否熟练
实验六 细菌芽孢染色法
一、目的要求
1、学习并掌握芽孢染色法的原理和技术，了解芽孢的形态特征。
2、巩固显微镜操作方法。
二、基本原理
芽孢是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常是圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢及芽孢的形状、在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。因芽孢壁厚、透性低、不易着色，但一旦着色也很难脱去。当用着色力强的染色剂（如孔雀绿、石炭酸复红）在加热条件下染色时，染料可进入菌体和芽孢内，但菌体内的染料经水洗可脱掉，芽孢内的染料依然存在呈色。用对比度大的复染剂染色时，芽孢保留初染剂的颜色，菌体和芽孢囊呈现复染剂的颜色。
三、实验器材
1、 菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）48h斜面培养物。
2、 染色剂：石炭酸复红染液，5%孔雀绿水溶液。
3、仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，镊子、接种环、载玻片夹子、滤纸等。
四、实验步骤
Schaeffer-Fulton氏染色法：
1、制片：涂片、干燥、固定。
2、染色：5%孔雀绿滴在涂片上，夹子夹住玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸气开始计时5分钟。
3、水洗：待玻片冷却后用流水冲洗至流出的水为无色。
4、复染：番红染液复染2分钟，水洗，干燥。
5、镜检
五、注意事项
1、实验三、四的注意事项适用于本实验。
2、选取适当菌龄的菌种进行芽孢染色，幼龄菌尚未产生芽孢，老龄菌芽孢囊已破裂，不易获得正确染色结果。
3、加热时间和温度要适宜，否则芽胞不易着色或温度过高导致菌体或芽孢囊破裂。
4、在将孔雀石绿染液加热时切不可蒸干。
5、脱色时必须等玻璃片冷却后再进行，否则冷水冲洗易导致玻片破裂。
6、注意安全，谨防烫伤和使用酒精灯时可能引发的火灾。
六、实验结果
观察、拍摄并说明枯草芽孢杆菌的形态特征。
七、思考题
为什么芽孢染色需要进行加热？能否用简单染色法观察到细菌芽孢？
八、讲授重点
1、芽孢染色原理和Schaeffer-Fulton氏染色方法。
2、细菌芽孢的形态。
九、实验要求
每位同学完成1个芽孢染色标本片，进行观察、拍照。记录染色结果。提交1张在油镜下观察到的细菌形态图，标明菌种名称和总放大倍数。
十、考核点
1、染色结果是否正确
2、涂片质量
3、显微镜操作是否熟练
第四次实验（4学时，1人/组）
微生物个体形态和群体形态观察（P69-76）
实验七 放线菌个体形态和菌落形态观察
一、目的要求
1、学习并掌握放线菌几种制片方法和简单染色的基本技术。
2、掌握放线菌个体细胞和菌落的形态特征，并注意与霉菌、酵母菌的相互区别。
二、基本原理
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌，常见放线菌大多能形成菌丝体。紧贴培养基表面或深入培养基生长的叫营养菌丝（基内菌丝，较透明较细），其生长到一定阶段能向空气中生长，叫气生菌丝（较粗，色较暗），由气生菌丝分化形成孢子丝及孢子。孢子丝成螺旋形、波浪形或分枝状等，孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。气生菌丝、孢子丝和孢子的形态、颜色常作为放线菌分类的重要依据。制片时通常采用插片法并结合简单染色进行观察，也可以用印片法将放线菌菌落或菌苔表面的孢子丝印在载玻片上，经简单染色后观察。
放线菌菌落干燥、不透明、表面呈致密的丝绒状，上有一薄层“干粉”。 酵母菌是一类呈单细胞生长的真核微生物的总称，少数能形成假菌丝。酵母菌的菌落较湿润，与细菌菌落较相似，但不透明。
三、实验器材
1、菌种：链霉菌（Streptomyces sp.)插片平板培养物。
2、染色剂：吕氏碱性美蓝染液，石炭酸复红染色液。
3、仪器和其他用品：显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、滤纸片、接种环、接种铲、镊子等。
四、实验步骤
（一）插片染色法
1、取盖片：取出放线链霉菌插片平板培养物，用镊子轻取盖片，擦去背面培养物。
2、固定：用酒精灯微热固定。
3、染色：用碱性美蓝染液或石炭酸复红染色液染色 1-2分钟。
4、水洗、干燥
5、观察：菌面朝上置于载片上，镜检观察。
（二）菌落形态观察
对放线菌琼脂平板上的菌落进行仔细观察，记录菌落大小、形状、透明程度、颜色、表面干燥或湿润，能否易挑取等特征。
五、注意事项
1、放线菌插片法操作过程中，在移动附着有菌体的盖玻片时勿碰动菌丝体，菌面需朝上，以免破坏菌丝体的形态。
2、插片法观察个体形态时，宜用微调节器分别聚焦，以便清晰观察到处于不同焦平面上的孢子、孢子丝、气生菌丝和基内菌丝。
3、观察菌落时，注意正反两面的颜色和菌落表面的薄层“干粉”，仔细分辨与霉菌菌落的异同点。不要随意移动开盖，以免孢子飞散污染实验室。
六、实验结果
绘图并说明所观察到的放线菌的形态特征。
七、思考题
镜检时如何区分基内菌丝、气生菌丝和孢子丝？
八、讲授重点
1、放线菌个体和菌落的一般形态特征。
2、插片法观察放线菌个体形态的方法和操作要点。
九、实验要求
每位学生利用插片染色法观察、拍照。提交1张在高倍镜下观察到的放线菌形态图，标明菌种名称和总放大倍数。
描述菌落特征。
十、考核点
能否区分放线菌的基内菌丝、气生菌丝、孢子丝和孢子。
实验八 酵母菌形态观察及死、活细胞的鉴别
一、目的要求
1、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式。
2、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的原理和染色方法。
3、了解酵母菌的个体和菌落形态特征，及其与细菌的区别。
二、基本原理
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，少数能形成假菌丝，通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，故具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。
酵母菌的菌落较湿润，与细菌菌落较相似，但不透明，有特殊的酒香味。
三、实验器材
1、菌种：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的平板培养物。（提供空气中细菌培养平板，用于酵母和细菌菌落形态的比较观察）。
2、染色剂：吕氏碱性美蓝染液，石炭酸复红。
3、仪器和其他用品：显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、滤纸片、接种环、镊子等。
四、实验步骤
1、酵母个体形态及死活细胞观察
在载玻片上滴加1小滴生理盐水，用接种环挑取少量菌苔，涂布均匀 - 在载玻片中央滴加1小滴吕氏碱性美蓝染色液（0.1%）混合均匀 - 盖上盖玻片 - 放置3分钟 - 先低倍后高倍镜下观察酵母形态和出芽情况 - 30分钟后再观察。并根据颜色来区别死活细胞，蓝色细胞是死细胞，无色细胞是活细胞。
2、菌落形态观察
仔细观察酵母菌菌落，记录菌落大小、形状、透明程度、颜色、表面干燥或湿润，能否易挑取等特征，注意与细菌菌落的区别。
五、实验过程中的注意事项
1、酵母菌制片时，当菌体与染液混合时注意不要剧烈涂沫，以免破坏细胞。
2、生理盐水和染液滴加量均要适中，盖盖玻片时，染液过多易溢出，过少易产生气泡。盖玻片缓慢倾斜覆盖，能避免产生气泡。
3、观察菌落特点时，注意其表面是否湿润、大小和形态，注意与细菌菌落的区别。
六、实验结果
1、绘图说明显微镜下所观察到的酵母菌的形态特征。
2、根据你所观察到的吕氏美蓝染液作用时间与酿酒酵母死、活细胞数量变化的情况，填写表4-1。
表4-1 酵母染色结果记录表
七、思考题
在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？
八、讲授重点
1、酵母死活细胞鉴定原理。
2、酵母细胞的个体形态，注意出芽繁殖方式是其主要特点。
3、怎样分辨酵母与细菌菌落。
九、实验要求
每位学生染色观察、拍照。提交2张在高倍镜下观察到的酵母染色形态图，标明菌种名称、总放大倍数、观察时间。
描述菌落特征。
十、考核点
1、无菌操作是否熟练规范
2、制片
3、显微镜操作是否熟练规范
实验九 霉菌的个体形态和菌落形态观察
一、目的要求
1、学习并掌握霉菌的制片技术。
2、了解常见霉菌（青霉、曲霉、根霉等）形态特征和相互区别。
3、了解霉菌菌落形态特征及其与放线菌、酵母菌和细菌菌落的相互区别。
二、基本原理
霉菌可产生复杂分枝的菌丝体，分为基生菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段后分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。 霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及其孢子的形态特征是分类的重要依据。可用直接制片法和透明胶带法观察，也可采用载玻片培养观察法观察常用石炭酸美蓝染液对霉菌进行染色，盖上盖玻片后直接镜检。
根霉营养体是无隔多核菌丝体，营养菌丝产生匍匐菌丝，以跳跃方式蔓延生长，在匍匐丝交接处长出假根，上方长出孢囊梗，顶端膨大成孢子囊，有囊轴、孢囊孢子、囊托。有性生殖产生接合孢子，接合孢子外无附属丝。曲霉菌在营养菌丝的足细胞上长出无隔的分生孢子梗，顶端膨大形成顶囊，在顶囊的表面上长出单层或双层小梗，在小梗顶端分化出串珠状的分生孢子。青霉菌菌丝体有隔，从菌丝细胞长出分生孢子梗，有隔有分枝，小梗有单轮或双轮生，双轮生中又分为对称和不对称。分生孢子梗的分枝和轮生组成了复杂的扫帚状分枝结构。在扫状枝上，最后一级分枝为产生串生链状分生孢子的小梗，呈瓶梗状，着生小梗的细胞叫梗基，支持梗基的细胞叫副枝。分生孢子常为球形、椭圆形，呈蓝绿色。
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗很多，是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，用低倍镜即可观察。
群体（菌落）形态：霉菌呈丝状生长。菌丝也分营养菌丝和气生菌丝。菌丝以菌丝体的形式行使其功能。霉菌的菌落呈明显的丝状体，但与放线菌菌落相比比较疏松，一般呈绒毛状、颗粒状、棉絮状等。
三、实验器材
1、菌种：毛霉（Mucor sp.）、青霉（Penicilliun sp.）、曲霉(Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus sp.)的平板培养物。
2、染色剂：吕氏碱性美蓝染液或石炭酸复红染色液。
3、仪器和其他用品：显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、滤纸片纸、解剖针、镊子、生理盐水等。
四、实验步骤
1、霉菌直接制片及菌体观察
取干静载玻片，中央滴加一滴染色液， 用解剖针从菌落边缘处挑取少量已产生孢子的霉菌菌丝放在染液中，用解剖针仔细将菌丝分散开，盖上盖玻片。低倍镜观察后转高倍镜观察。
2、透明胶带制片法
取干静载玻片，中央滴加一滴染色液， 用食指和拇指粘在一段透明胶带两端，使透明带呈U形，胶面朝下，使呈U形 ， 用透明胶带面轻轻触及霉菌菌落表面 ， 使粘在透明胶带上的菌体浸入载玻片上的染液中，并将胶带两端固定在载片两端。低倍镜观察后转高倍镜观察。
3、菌落形态观察：仔细观察霉菌的琼脂平板上的菌落，记录每种霉菌的菌落大小、形状、颜色、表面是否有小黑点名小颗粒，能否易挑取等特征。
五、注意事项
1、制片时，取菌和分散菌丝要细心，要从菌落边缘取，不要只取大菌落中央的菌丝，否则观察不到完整菌丝体的结构。
2、不要搅动菌丝体，尽量减少菌丝断裂及形态的被破坏，盖盖玻片时避免了产生气泡。
3、若视野中只见孢子，不见霉菌的其它部分时，可对挑取的霉菌菌丝体，用50%的酒精浸一下，以除去脱落的孢子，再制片、染色和观察。。
4、观察菌落特征时，要选择分离得很开的单个较大菌落；
5、勿随意移动开盖，以免孢子飞散污染实验室。
六、实验结果
1、拍摄并说明所观察到的四种霉菌的形态特征。
2、根据你对琼脂平板上的放线菌、酵母菌和四种霉菌的的菌落观察，将结果记录在表4-2。
表4-2平板菌落观察结果记录表
七、思考题
1、在进行微生物制片时是否都需要进行涂片？为什么？
2、黑曲霉和黑根霉在形态特征上有何区别？
八、讲授重点
1、四类常见霉菌各自的典型特征
2、直接制片观察法与透明胶带法
九、实验要求
每位学生制作4个标本片，观察、拍照。提交4张在高倍镜下观察到的霉菌形态图，标明菌种名称、总放大倍数。
描述菌落特征。
十、考核点
1、制片技术
2、显微镜操作是否规范熟练
第六次实验（4学时，1人/组）
微生物的大小和数量测定
实验十 微生物大小的测定
一、目的要求
1、学习并掌握使用显微测微尺测定微生物的大小的方法。
2、掌握对不同形态细菌细胞大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识。
二、基本原理
1、 微生物的大小是微生物重要的形态特征之一，分类鉴定的依据；
2、 目镜测微尺和镜台测微尺是测量工具。
微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。
三、实验器材
1、活材料：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面菌种(菌悬液)
2、溶液和试剂
香柏油， 乙醇乙醚
3、仪器和其他用品：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、滴管、擦镜纸。
四、实验步骤
1、目镜测微尺的安装和校正
把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm
用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。
由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。
2、微生物大小的测定
(1)将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10-2）
(2)取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。
(3)移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10—20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。
（4）同法用油镜测定微生物染色标本的长和宽。
五、注意事项
1、目镜测微尺很轻、很薄，在取放时应特别防止使其跌落而损坏；
2、观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度；
3、小心进行镜头的转换，防止接物镜压坏测微尺和损坏镜头；
4、目镜测微尺的安装方向；
5、显微镜下镜台测微尺的刻度线较粗，注意判断两线重叠时采用的标准要一致。
六、实验记录与结果
将实验结果填入下列表格
表6-1 目镜测微目尺校正结果
目镜放大倍数：
表6-2酵母菌大小测定记录
酵母菌大小：宽μm×长μm＝
结果计算 长μm＝平均格数×校正值
宽μm＝平均格数×校正值
大小表示：宽μm×长μm
七、思考题
1、为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？
2、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果时候相同？
八、讲授重点
1、微生物大小是分类鉴定的依据；
2、目镜测微尺和镜台测微尺的工作原理；
3、目镜测微尺和镜台测微尺的安装。
九、考核点
目镜测微尺和镜台测微尺的安装和校正
实验十一 微生物数量的测定
一、目的要求
1、学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法；
2、了解光电比浊法的原理；
3、学习、掌握光电比浊法的操作方法。
二、基本原理
测定微生物细胞数量的方法很多，显微直接计数法和光电比浊法是较常用的两种方法。
1、显微计数法的使用：显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血细胞计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
2、血细胞计数板的构造和使用原理：血细胞计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用血细胞计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。
因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）。
3、光电比浊法的原理：当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出(图15-4)。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用血细胞计数板计数。
光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在400~700nm 之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。
三、实验器材
1、活材料：酿酒酵母斜面或培养液。
2、溶液和试剂：无菌生理盐水
3、仪器和其它用品：显微镜、酒精灯、721 型分光光度计、血细胞计数板、盖玻片、吸水纸、滴管、擦镜纸、无菌吸管。
四、实验步骤
（一）血细胞计数法
1、菌悬液制备：
视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。
2、检查血细胞计数板
3、加样品
将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
4、显微计数
计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
5、清洗
测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
（二）光电比浊计数法
1、标准曲线制作
（1）编号 取无菌试管7 支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6。
（2）调整菌液浓度 根据血细胞计数板计数结果将酿酒酵母菌悬液用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106 含菌数的细胞悬液。再分别装入已编好号的1 至6号无菌试管中。
（3）测OD 值 将1 至6 号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm 波长、1cm 比色皿中测定OD 值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照。
(4)以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。
2、样品测定
将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用560nm 波长、lcm 比色皿测定光
密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。
各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。
3、根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。
五、注意事项
1、菌悬液的制备用接种环取样刮取要轻;
2、计数板的清洗；
3、取样时要摇匀，加样时不能有气泡，静置5分钟后再观察；
4、观察时适当减低视野亮度，增大反差；
5、压线细胞和芽体的计数方法；
5、每管菌悬液在测定OD 值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定。
六、实验记录
血细胞计数结果填入表6-3：
菌数/mL=
菌液OD值填入表6-4:
待测样品浓度＝ 菌数/mL
七、思考题
1、结合你的实验体会，总结哪些因素会造成血细胞计数板的计数误差，应如何避免？
2、微生物光电比浊计数的原理是什么？这种计数法有何优缺点？
八、讲授重点
1、显微计数法的使用。
2、血细胞计数板的构造和使用原理。
3、光电比浊计数法的原理。
4、血细胞计数板的使用。
九、考核点
1、中格和小格的区分；
2、血细胞计数板加样的操作；
3、分光光度计的正确使用（仪器操作，样品是否混匀）。