实验二 细菌的革兰氏染色

【目的要求】

1. 掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤

2.掌握革兰氏染色法的步骤和关键点

3.识别细菌的革兰氏染色结果

【材料和用品】

1.菌种：培养18小时至20小时的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。

2.染料：草酸铵结晶紫液、革兰氏碘液、95%乙醇、番红复染液。

3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、拭镜纸、火柴、无菌生理盐水、吸水纸、香柏油、二甲苯等。

【实验内容与方法】

1.涂片

取两块载玻片，各滴加一小滴无菌的生理盐水（或蒸馏水）于载玻片中央，用接种环以无菌操作从大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。同样方法从枯草牙孢杆菌或金黄色葡萄球菌的斜面上挑取少许菌苔涂片于另外的载玻片上。

注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。

2.干燥

室温自然干燥。

3.固定

涂面朝上，在火焰过2~3次。

此操作全过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。

4.初染

滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1~2min，水洗。

5.媒染

用革兰碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

6.脱色

用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色，立即水洗，时间大约为30s左右。

7.复染

用番红染液复染约2min，水洗。

8.镜检

将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，微调细调节器使物像清晰。之后换油镜观察，在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加1~2滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止，仔细观察并记录观察到的结果。

菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。

9.混合涂片染色

按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。

10.油镜用后的处理

（1）上升镜筒（或下降载物台），取下载玻片。

（2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的拭镜纸擦去残留的二甲苯。

切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。

【实验报告】

按实验目的的要求完成实验内容和实验报告，报告要求：

1. 列表简述3种细菌的染色结果（说明各菌的形状、颜色和革兰染色反应）

2.分别绘出观察到的细菌形态图

【实验结果讨论】

1.在进行细菌制片时应注意什么？

2.你的革兰染色结果与课本（或网上资料）中所述是否一致？哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？

第二篇：实验一 细菌的革兰氏染色

实验一细菌的革兰氏染色

日期10月27号星期三90节

一  实验目的

1 学习显微镜油镜的使用方法

2 学习微生物的无菌操作技术

3 学习细菌的革兰氏染色法

二 实验原理

1 显微镜及油镜物镜的使用原理

1) 油镜头的标志

油镜头上常刻有OI（oil immersion）或 HI（homogeous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记。在低倍物镜、高被物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical aperture）最大，而工作距离最短。

2 ) 显微镜的分辨率 显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它的分辨率的大小。分瓣率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比：

D=λ/2NA

从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。

数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积：

                 NA=n×Sinα/2

影响数值孔径大小的因素－是镜口角，二倍介质的折射率。

当物镜与玻片之间的介质为空气时，由于空气（n=1.0）与玻璃（n=1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃的相近，光线经过玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。

2 细菌的革兰氏染色原理

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类.

G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

三 实验器材

1 菌种：培养24h的枯草杆菌（ Bacillcus subtilis） 、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。

2 染色液和试剂： 生理盐水、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红复染液, 香柏油，显微镜擦拭液.

３器材：酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。

四 实验方法

1 涂片: 取一干净载玻片,中央滴一小滴生理盐水,无菌操作取菌

 无菌操作(快):在酒精灯上灼烧接种环(注意手势)---松动试管帽---取下试管帽---灼烧管口---在火焰旁接种环通过火焰进入菌种管---接种环在管壁冷却---挑取菌少许---退出---灼烧管口---盖帽---涂片(调匀涂成薄膜)---灼烧接种环.

2 干燥: 室温自然凉干

3 固定: 手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）.

4 染色: 初染(加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,自来水水洗)---媒染(加碘液冲去残水,并覆盖一分钟,水洗)---脱色(将水甩净,衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出的酒精不出现紫色时为止,约20-30秒,立即用水冲净酒精)---复染(用蕃红液染2-3分钟,水洗)

5 干燥:室温凉干或吹风机吹干

6 镜检:先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，油观察细菌的形态。

五 实验现象

1 枯草杆菌

革兰氏阳性杆菌，杆形，不规则排列，紫色

2 金黄色葡萄球菌

革兰氏阳性球菌，圆球形，不规则排列，紫色

3 大肠杆菌

革兰氏阴性杆菌，杆形，不规则排列，红色

六 实验结果及思考题

１　用油镜观察时玻片为什么要完全凉干?

答：当玻片未完全晾干时，残留的水会使折射率增大，使景象模糊。

２　叙述无菌操作时应注意的问题。

答：接种环在接种前后都需灼烧，试管盖不可随处放置，取菌株时需穿过火焰。

３　绘出所观察细菌的菌体形态并注明革兰氏染色反应阳性和阴性。

4  革兰氏染色成败的关键是什么?

答：染色时间。

5 对一个未知菌进行革兰氏染色,怎样确定你的染色技术正确结果可靠?

答：在玻片上再各涂革兰氏阴性菌、阳性菌，其他处理方式与待验证菌株相同，观察结果，若对比组正确，则可判断其技术可靠。