实验二 细菌的革兰氏染色法

一、目的要求

1. 掌握革兰氏染色的方法及原理。

2. 进一步熟悉显微镜的使用

二、基本原理

1. 革兰氏染色的意义：

革兰氏染色的反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医生Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将

+所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G表示；

染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。

2. 革兰氏染色的原理：

细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

三、器材

大肠杆菌，金黄色葡萄球菌12～20h斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。

四、操作步骤

1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。

载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。

2. 干燥 室温自然干燥。

3. 固定 固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。

热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。

4. 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。

5. 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。

6. 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。

7. 复染 用番红液染1～2min，水洗

8. 镜检 干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

补充：混合涂片法

按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片、染色、镜检进行比较。

五、注意事项

1 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。

2 菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

六、实验报告

1. 绘出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图，注明放大倍数及颜色。

2. 列表说明P84

第二篇：细菌的简单染色

实验二 细菌的简单染色、革兰氏染色

虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。

本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其他的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。

一、目的要求

1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。

2．巩固显微镜的使用方法。

二、基本原理

1.简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。

在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：

带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。

细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。

2.革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。

G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染

的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是复红。

三、器材

1、活材料：培养24小时的大肠杆菌和葡萄球菌。

2、染色液和试剂：碱性美兰、结晶紫、碘液、95%酒精、石炭酸复红 、蒸馏水、乙醚-乙醇混合液、香柏油。

3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。

四、操作步骤

1、简单染色：

（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法取大肠杆菌涂片，调匀并涂成薄膜，注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀，做成浓菌液，注意取菌不要太多。

（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。

（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜），使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏

（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min

（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液，直至冲下之水无色时为止。

（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。

（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。

2、革兰氏染色：

（1）涂片

（2）晾干

（3）固定，与简单染色法相同

（4）结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。

（5）媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。

（6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。

（7）复染：滴加复红复染3-5min；水洗：用水洗去涂片上的复红染色液。

（8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。

（9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

（10)实验完毕后的处理：

①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，

a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。

b.用擦镜纸沾少许乙醚-乙醇混合液将镜头擦2-3次。

c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。

②观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。

五.注意事项

1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。

2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

五、实验报告

1．结果

绘出葡萄球菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。

2．思考题

（1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？

（2）其染色成败的关键一步是什么？