植物组织中总糖和还原糖含量的测定（蒽酮比色法） 2010-5-24
一、实验目的
掌握蒽酮比色法测定总糖和还原糖含量的原理和方法，学会正确使用分光光度计。
二、实验原理
游离的己糖或多糖中的己糖基、戊糠醛及己糖醛酸在浓硫酸的作用下脱水生成糠醛衍生物，糠醛衍生物与蒽酮缩合成蓝色的化合物，在620nm处有最大吸收，在一定糖浓度范围内（200ug/ml），溶液吸光度值与糖溶液的浓度成线性关系。用酸将植物组织中没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，或直接提取植物组织中的还原糖，即可对植物组织中的总糖和还原糖进行定量测定。
三、实验材料
1．可见分光光度计、电子天平(1/100)、粉碎机、水浴锅、电炉。
2．研钵、量筒、三角烧瓶、烧杯、容量瓶、玻璃漏斗、试管1.5cm×15cm、刻度吸管、胶头滴管、pH试纸、坐标纸。
3．植物原料，如银耳、木耳、菜叶等。
四、实验试剂
1．蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于l000ml体积分数为80％的硫酸中，当日配制使用。
2．标准葡萄糖溶液(0.1mg／m1)：称取100mg葡萄糖，溶于蒸馏水并稀释至1 000ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）。
3．6mol／L HCl溶液：50ml盐酸，加水至100ml。
4．10％NaOH溶液：称取10g NaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100ml。
五、操作步骤
1．葡萄糖标准曲线的绘制
取干净试管6支，按下表进行操作。以吸光度为纵坐标，各标准液浓度(mg／m1)为横坐标做图。
2．样品中还原糖的提取和测定
称取植物原料干粉0.1～0.5g，加水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。于50℃水浴中保温半小时（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100ml。过滤，取lml滤液进行还原糖的测定：吸取lml总糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。（样品液显色后若颜色很深，其吸光度超过标准曲线浓度范围，则应将样品提取液适当稀释后再加蒽酮显色测定）。
3．样品中总糖的提取、水解和测定
称取植物原料干粉0.1～0.5g，加水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12ml的蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。再向三角烧瓶中加入6mol/L盐酸10ml，搅拌均匀后在沸水浴中水解半小时，冷却后用10％NaOH溶液中和pH呈中性。然后用蒸馏水定容至100ml，过滤，取滤液10ml，用蒸馏水定容100ml，成稀释1000倍的总糖水解液。取lml总糖水解液，测定其还原糖的含量：吸取lml总糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。
六、实验结果
按照下列公式分别计算植物原料干粉中还原糖和总糖的质量分数（ω）。
ω（还原糖）= （C1V1/m）×100％
①ω（总糖）= （C2V2/m）×0.9×100％
式中 ω（还原糖）：还原糖的质量分数（％）；ω（总糖）：总糖的质量分数（％）； C1：还原糖的质量浓度（mg／ml）；
C2：水解后还原糖的质量浓度（mg／ml）；
V1：样品中还原糖提取液的体积（m1）；
V2：样品中总糖提取液的体积（m1）；
m ：样品质量（mg）。
注①：计算总糖含量的公式，在测定干扰杂质很少、还原糖含量相对总糖含量很少时适用，乘0.9是为了从测定出的总糖水解成的单糖量中，扣除水解时所消耗的水量。
七、注意事项
1．总糖：食品中的总糖通常是指具有还原性的糖（葡萄糖,果糖,乳糖,麦芽糖等）和在测定条件下能水解为还原性单糖的糖的总量。
2． 本法适用于可溶性还原糖测定。测定结果是还原性糖和能水解为还原性糖的总和。
3． 如要求结果中不含淀粉，则样品处理不应用高浓度酸，而应改用80%乙醇。
4． 如提取液中有较多的可溶性蛋白，必须先除去蛋白。
5． 若样液较深，可用活性碳脱色。
第二篇：二可溶性总糖的测定(蒽酮比色法)
摘要： 一、目的 掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。 二、原理 强酸可使糖类脱水生成糠醛，生成的糠醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质在 620 nm 处有最大吸收 . 在 10 -100
一、目的
掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法.
二、原理
强酸可使糖类脱水生成糠醛,生成的糠醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合,形成糠醛的衍生物,呈蓝绿色,该物质在 620 nm 处有最大吸收 . 在 10 -100ug 范围内其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比.
这一方法有很高的灵敏度,糖含量在 30ug 左右就能进行测定,所以可做为微量测糖之用.一般样品少的情况下,采用这一方法比较合适.
三、仪器、试剂和材料
1 、仪器
（1）分光光度计
（2）电子顶载天平
（3）三角瓶： 50m1 X 1
（4）大试管： 9 支
（5）试管架,试管夹
（6）漏斗,漏斗架
（7）容量瓶： 50rnl X 2
（8）刻度吸管： 1m1X3 ， 2m1X1 ， 5mlX1
（9）水浴锅
2、试剂
（1）葡萄糖标准液： l00ug/ml
（2）浓硫酸
（3）蒽酮试剂 :0.2g 蒽酮溶于 100 ml 浓 H2SO4 中当日配制使用.
3、材料 小麦分蘖节。
四、操作步骤
1 、葡萄糖标准曲线的制作
取 7 支大试管,按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液：
在每支试管中立即加入蒽酮试剂 4.0m1 ,迅速浸于冰水浴中冷却,各管加完后一起浸于沸水浴中,管口加盖玻璃球,以防蒸发.自水浴重新煮沸起,准确煮沸 l0min 取出,用流水冷却,室温放置 10min ,在 620 nm 波长下比色.以标准葡萄糖含量（ ug) 作横坐标,以吸光值作纵坐标,作出标准曲线.
2 、植物样品中可溶性糖的提取
将小麦分蘖节剪碎至 2mm 以下,准确称取 Ig, 放入 50m1 三角瓶中,加沸水 25m1 ,在水浴中加盖煮沸 10min ,冷却后过滤,滤液收集在 50m1 容量瓶中,定容至刻度.吸取提取液 2m1 ,置另一 50m1 容量瓶中,以蒸馏水稀释定容,摇匀测定.
3、测定
吸取 lml 已稀释的提取液于大试管中,加入 4.Oml 蒽酮试剂,以下操作同标准曲线制作.比色波长 620nm ,记录吸光度,在标准曲线上查出葡萄糖的含量（ ug ）.
查表所得糖含量（ ug ）×稀释倍数
五、结果处理
六、注意事项
1、该显色反应非常灵敏,溶液中切勿混入纸屑及尘埃.
2、 H 2 SO 4 要用高纯度的.
3、不同糖类与蒽酮的显色有差异,稳定性也不同.加热、比色时间应严格掌握.
七、思考题
1、用水提取的糖类有哪些？
2、制作标准曲线时应注意哪些问题？
实验步骤
1． 求标准曲线方程
取6只试管，按下表配制（移取）葡萄糖（G）标准溶液，沸腾7分钟取出，用自来水冷至室温，用721分光光度计比色，波长620nm，1＃管作为参比(保留)，求标准曲线方程。（G浓度为200μg／mL，蒽酮试剂：2克蒽酮／每升85%H2SO4）
2. 样品含糖量的测定
（1）取菜叶（包菜和白菜两个样）准确称取1.00克剪碎研细后，放入大试管，加入25mL蒸馏水，煮沸10分钟，通过漏斗滤入250mL容量瓶中（可以抽滤），并用煮沸蒸馏水提取两次，滤液并入容量瓶中，滤纸上的残渣用水冲两次，冷却定容至刻度。
（2）吸取0.5mL滤液于编号的三只试管中，以蒸馏水补足1.00mL；另吸取1.00mL滤液于另编号的三只试管中，加蒽酮试剂5.0mL（于冷水浴中操作），摇匀后于沸水浴中煮沸7分钟，取出冷却至室温，以求标准曲线的1＃管作为参比，用721分光光度计在620nm处测吸光度或透过率。
最小二乘法求标准曲线方程的公式：
X：G的浓度（μg／mL）Y：吸光度A＝－㏒T
本实验要求相关系数r≥0.99