常见的报告基因

报告基因必须具备的特点：①由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别；

②细胞内其他基因产物不会于扰报告基因产物的检测；③报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高，

而且重现性好。到目前为止，报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连，

先让质粒在大肠杆菌中进行增殖，再提取质粒，转染人感兴趣的真核细胞中。与此同时还要将有真核启动子和增强子的 另一种报告基因质粒共转染同一细胞，作为转染率的内对照。

(1)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)：该报告基因来源于大肠杆菌转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。 氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。CAT在哺乳细胞无内源性表达， 性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(enzyme—linkedimmunosorbantassay， ELISA)检测其活性，也可进行蛋白质印迹(Westernblotting)和免疫组织化学分析。CAT与其他报告基因相比，

线性范围较窄，灵敏性较低。

(2)β半乳糖苷酶：β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。最大优势是易于用免疫组织化学法 观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。以邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用 标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红—β—D—半乳吡喃糖苷(CPRG)是另一个可用比 色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和荧光素二半乳糖苷(FDG)为底物则可用荧光法检 测其活性。此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学(FACS)分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学 发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。

(3)荧光素酶：荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有 细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。 萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范围宽达7～8个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因，用荧光比色计即

可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞 即可检测酶活性。Renilla荧光素酶催化肠腔素(coelenterazine)氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报 告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。

自19xx年起，萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得了广泛的应用。Promega公司的pGL3及pGL2系列 载体，含SV40启动子及增强子的不同组合，有助于分析DNA片段的转录活性。

荧光素酶报告基因有许多优点：①非放射性；②比CAT及其他报告基因速度快；③比CAT灵敏100倍；④荧光素酶 在哺乳细胞中的半衰期为3小时，在植物中的半衰期为3．5小时。由于半衰期短，故启动子的改变会即时导致荧光素酶 活性的改变，而荧光素酶不会积累。相反，CAT在哺乳细胞中的半衰期为50小时。荧光素酶浓度在10—16mol／L(10pS／L )到10-8mol／L(1mg／L)范围内，荧光信号强度与酶浓度成正比。在理想条件下，可检测到l0-20mol／L的荧光素酶。 Promega公司的荧光素酶检测系统比一般的方法灵敏及简单，产生的光稳定。

(4)分泌型碱性磷酸酶(SEAP)：SEAP是人胎盘碱性磷酸酶的突变体，无内源性表达。SEAP缺乏胎盘碱性磷酸酶羧基末端 的24个氨基酸。其优点是无需裂解细胞，只用培养介质即可检测酶活性，便于进行时效反应试验。以间硝基苯磷酸盐(PNPP) 为底物时可用标准的比色法测定酶活性，操作简单，反应时间短，价格廉价，但灵敏度低。以黄素腺嘌呤二核苷酸磷酸 为底物进行比色测定，其灵敏度增高。SEAP可催化D—荧光素—O—磷酸盐水解生成D—荧光素，后者又可作为荧光素 酶的底物，此即两步生物发光法检测酶活性的原理。此方法灵敏度高，接近于荧光素酶报告基因的检测。还可用一步化学 发光法检测酶活性。

(5)荧光蛋白家族：荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为20 000～30 000的同源蛋白。绿色荧光 蛋白(GFP)是应用最多的发光蛋白。GFP存在于发光水母(AequoreaVictoria)中。用395 Bin的紫外线和475 nm的蓝光激发， GFP可在508nm处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物。GFP最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内事件。 19xx年克隆了GFP基因，目前已获得几个突变体，如“红色迁移”突变体(red—shiftmutant)，其荧光更强。其他突变体还有 蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型GFP(EGFP)和去稳定EGFP(destabilizedEGFP)等。红色荧光蛋白(RFP)是从珊瑚(Discosoma sp．) 中分离的发光蛋白(drFP583或DsRed)，可发射明亮的红色荧光。这些常用的报告基因也可被联合应用，同时检测2个甚至

3个基因的表达。报告基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围。稳定性好的报告基因适于基因转录动力学 研究和高通量筛选，尤其适用于基因转移的定性研究。

第二篇：报告基因

报告基因

定义

报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 特征

作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：

(1)已被克隆和全序列已测定；

(2)表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；

(3)其表达产物能进行定量测定。

应用

在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。目前常用的一种报告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。荧光酶基因(luc)是19xx年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。

在动物基因表达调控的研究中，报告基因也被广泛应用。常用的有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、二氢叶酸还原酶基因、荧光酶基因等。cat基因作为报告基因，检测时可通过放射自显影观察。荧光酶基因作为报告基因，具有

检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。

此外，在反式作用因子相互作用的检测方式枣酵母双杂交体系中，可通过报告基因的表达，研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。双杂交体系是由报告基因转录调控区、报告基因及一对可以相互作用的杂合反式作用因子组成。近年来从上述杂交体系中发展出的单一杂交体系技术，也是根据报告基因表达量的检测筛选出与已知顺式作用元件相结合的未知因子的DNA，该项技术正广泛应用于克隆细胞中含量微弱且用生化手段难以纯化的反式作用因子。

gus基因

gus基因就是转β-葡糖醛酸酶基因

该基因产物为GUS 蛋白质，相当稳定而不易降解，并为一水解酵素，有简易的测定方法；且可使用市售的基质 (substrate) 在原位 (in situ) 显现出酵素的活性，以肉眼即可检测其产物，非常方便。

gus基因存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。根据地gus基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高），其中最为常用的是组织化学法。

组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞发生了解gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法 可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。

GUS作为报告基因的优缺点

采用报告基因是gus基因，它具有以下一些优点：

①利用一个简单的组织化学检测就可以精确地分析gus融合基因的时空表达模式。

②GUS蛋白在转化植物细胞中稳定存在，它对较高的温度及去污剂有一定的耐受性。

③检测方法简单，可以进行定性和定量检测。以X-Gluc为底物，通过显色反应可直接观察组织器官中gus基因的活性；以4-MUG为底物，GUS蛋白可以催化其水解为4-MU和β-D葡萄糖醛酸，4-MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm荧光，可用荧光分光光度计定量检测。

④在大多数植物组织中GUS活性的本底低；

⑤检测时只需少量植物组织。

但是，在实验过程中也发现其存在一些不足：

① 染色不均匀。通常在伤口处较深。对材料进行抽真空处理可以提高GUS染液的渗透能力，但是不能从根本上解决这一问题；实验中发现对需进行染色的材料进行徒手切片，再进行染色会使染色效果得到改善。

② 不能进行活体染色。组织化学染色后愈伤失去继续培养的可能，在检测茎杆和叶鞘时会对材料造成很大的伤害及损失。

③ 不能进行亚细胞定位。如需要进行亚细胞定位，可用gfp作为报告基因。