中药血清药理学实验方法

摘要：本文通过从中药血清药理方法学中实验动物、给药剂量、给药方案、采血方案、血清灭活与保存、血清添加量等实验条件的确立进行了阐述，从而建立最佳的实验方案进行研究。并对血清药理学的不足做了简单的介绍，以及对其以后的发展进行了展望。

关键字：中药；血清药理学；给药方案；采血方案；血清处理

血清药理学是日本学者Hiroko Iwama[1]在19xx年第一届和汉医药学会上首次提出的。中药血清药理学是指将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液、分离血清，以含药血清代替中药粗提物作为药物源加入离体反应系统中从而研究其药理作用的一种半体内实验方法。近年来，我国越来越多的中药专家应用此法来研究中药药理作用。主要针对中药及其复方复杂多样的化学成分特点，用含药血清代替煎剂或粗提物进行体外实验，它 克服了中药粗制剂直接进行体外实验的缺点，其结果的可信度明显优于中药粗制剂直接用于体外实验。

血清药理学中医药研究中所表现出的优势[2]：①从方法学上解决了中药复方直接应用于离体实验的难点，使中医药研究能在离体实验中直接与分子生物学技术相结合，从而推动中医药现代化的进程；②从中药复方本身来讲，可克服体外实验不能直接观察到的复方经体内胃肠吸收、生物转化后的综合整体药理效应；③对含药血清的成分进行药效、药动学研究，可以发现中药复方发挥药效作用的物质基础，为探讨中药复方作用规律提供新思路；④可以用来验证一些中医学基础理论。血清药理学实验方法可以避免了中药直接进行体外用药所产生的影响，直接反映中药及其代谢产物的药理作用，从而相对有效地阐释中医药治病的科学机理，可以为中医药现代化研究研究提供依据。

1、实验动物的选择

在目前中药血清药理学研究中，常用大鼠、家兔、豚鼠等动物来制备含药血清。但动物的种属不同，其血清成分也有所不同，所以要尽量选择和人类生物学特征相近的物种[3]，从而缩小动物血清和人类血清在生理、生化等状态下的差异，减少因种属差异而造成的免疫反应，提高实验结果的可靠性[4]，否则其研究结果不会有太大的意义。此外，体外实验时应尽量使用与制备含药血清的动物同一种属的细胞、离体组织或器官等，这样可以减小动物血清和细胞，器官之间因种属差异而造成的免疫反应，从而提高实验结果的可靠性。由于动物在生理状态下与病理状态下对药物消化吸收不同，对药物生物转化不同，药物的作用下机体反应不同，即正常动物采集的血清和病理状态动物采集的血清的作用可能存在差异。因此，需要根据各实验要求选用不同的实验动物和不同状态下的实验动物。

2、给药剂量

确定实验动物后，就要考虑给药剂量，给药剂量的大小直接关系到所得到的血清中的含药量。但给药剂量不能过大或过小，剂量过小，得到的含药血清加入体外反应体系后，药物浓度会被稀释，从而可能低于在体条件下的药物浓度，出现因药物浓度过低而导致的阴性或假阳性结果。给药剂量也不能过大，要充分考虑到动物的承受能力以及因给药剂量过大而产生的毒副作用。常用的方法：①按照公式计算，给药剂量=临床用药量×动物等效剂量系数（按体表面积）×培养基内血清稀释度[5]。②按新药药理研究的技术要求设计剂量给药，将含药血清制成冻干粉，给实验动物灌服，使其含药血清达到所需要的浓度。不同药物的给药剂量也不相同，可以通过预实验探索具体合适的给药剂量，按照实际情况确定给药剂量，以保证实验的有效性和科学性。

3、给药方案

在进行血清药理实验之前，还需确定合适的给药方案，是否禁食、给药的次数以及给药间隔等都将会对血药浓度产生影响。食物可以改变胃肠道理化性质，影响其功能状态，减慢药物在体内的吸收过程，使血药浓度达到实验的要求的时间难以确定，甚至达不到实验要求。一般情况下，应在动物实验前禁食8~12h，保持空腹状态下进行实验，避免其他因素产生干扰。由于临床上中药复方制剂以一日内多次给药为主，因而制订一日内的给药方案势必直接影响到该制剂的疗效。一日内给药次数方案的确定,主要应考虑两个因素：能产生较好疗效的最低单次剂量和此有效单次剂量药效的持续时间[6]。而连续给药天数有3d的[7]，也有7d的[8]。还有人提出每日1次连续7~10d给药，每隔一个半衰期给药一次，连续4~6次。但由于中药及其复方成分复杂，半衰期很难测定，所以7~10 天给药方案是比较保险的给药方法。但是无论是什么样的给药方案，都是为了使药物在血液内达到稳态，从而便于药物机制的研究。

4、采血时间

为了避免由于药效物质尚未吸收或代谢殆尽而造成的假阴性结果，尽量在给药的峰浓度时间段内采血效果最好。但是不同的药物甚至同一药物的不同有效成分，达到峰浓度的时间都不尽相同[9]。有研究者认为多数药物的达峰时间在药后1~2h，采血时间定为给药后2h。也可在末次连续给药后2次，间隔1h，第2次药后1h采血。部分学者以含药物血清抗血小板释放5-HT和阻滞内皮细胞钙通道作用为指标，探讨影响中药血清药理学方法开展的重要因素——制备含药物血清的采血时间，并进行了时效关系的研究。结果显示：给药后30min采血所得血清作用最佳[10]。陈一江等[11] 给SD大鼠灌服中药温心汤煎剂3mL /只，2 次/d，共1d，分别于末次给药30、60、90、120min后腹主动脉采血，结果实验表明温心汤药物血清能明显提高离体蛙心心率及平均肌张力，并与所取温心汤药物血清的时间及浓度相关。 中药及其复方因含有多种活性成分，并非简单的加和产生疗效，中药及其复方的药效为其主要有效成分和次要有效成分的综合效应，作用机制尚未清楚。因此，不同的中药进行血清药理学实验都应该进行预实验确定其采血时间。

5、含药血清的处理和保存

血清中含有多种酶、抗体、补体及其他生物活性物质，它们对体外培养的细胞、病毒、病原菌以及直接用于体外实验的组织器官等是否会产生影响而干扰实验结果，血清灭活后会减少干扰因素对实验的影响。常用的处理方法[12]：（1）丙酮法，血清内加入4~5倍体积丙酮,混匀后于3000r/min离心,取上清液温水浴上蒸发, 除去丙酮。（2）乙醇法，血清内加人4~5倍体积95%乙醇, 混匀后于3000r/min离心,取上清液温水浴上蒸发,除去乙醉。（3）加温法，56 ℃水浴30min灭活。也有学者认为血清中的补体等成分可能参与中药效用过程，尤其是抗病毒类中药，灭活后会对实验结果产生影响，并且灭活处理后的血清与正常人体过程不相符合。韩俭等[13]通过实验证明灭活后的含药血清对四种细菌均无抑制作用，而未灭活含药血清对流感嗜血杆菌、大肠杆菌（均为G-菌）有明显抑制或杀灭作用。低温冷冻真空抽干从理论上讲不应该破坏血清中的蛋白质成分，却出现阴性结果，说明处理过程丢失了药物诱导产生的有协助补体作用的活性成分或使其活性减弱。实验表明中药血清抗菌试验血清处理必须用新鲜血清试验。

大部分实验都采取对含药血清进行低温保存。周明眉等[14]以含头风饮血清抗血小板释放5-HT和阻滞内皮细胞钙通道作用为指标，探讨了含药血清低温保存和血清灭活的影响。结果表明含药血清经长时间低温保存后药效均显著降低。对含药血清进行低温冰冻保存仍会影响其药效。所以进行血清药理学实验，应尽可能使用新鲜灭活血清或保存时间较短的含药血清。

6、血清添加量

随着反应体系中含药物血清加入量的逐渐增加，其药理效应曲线是呈正态分布状，说明并不是添加量越大越好，高浓度的含药血清会表现出对细胞的毒性作用，有学者报道含药血清在高浓度时可抑制细胞增殖，因而体外实验中含药血清的浓度选取10%[15]。王霖等[16]通过实验证明含药血清1∶9稀释时，血清对细胞毒性基本消失。

血清药理学在中药复方研究中得到了广泛的应用，比如在心血管系统、抗炎、抗菌、抗病毒[8]以及抗肿瘤[17]等方面中的应用。但在有些研究方面存在一些争议，有学者指出在体外实验中，全血、血浆和血清三者之间存在明显的差别，并对中药血清药理学提出质疑，建议用含药血浆代替含药血清[18]。有研究证明，含药血浆中的药效成分含量高于含药血清[19]。鉴于血清与血浆存在的差异，为反映体内的实际情况，越来越多学者主张在医学研究与临床检验中，特别是蛋白组学、肽组学与代谢组学研究，最好采用血浆，只有在抗凝剂干扰检验结果的情况下，才考虑采用血清。

尽管血清药理学在研究存在一些问题，但它依旧是中药复方研究中一种不可或缺的方法。随着各个学科的发展，也会推动它的发展，以后也会通过血清药理学方法对中药以及复方制剂的作用机制作出更加科学的阐释。相信中药血清药理学方法会对今后的中医药领域的研究作出重大的贡献。

参考文献：

[1] Hiroko Iwama, Sakae Amagaya, Yukio Ogihara. Effect of shosaikoto a japanese and chinese traditional herbal medicinl mixture, on the mitogenic activity of lipopolysaccharide: a new pharmacological testing method[J]. Journal of Ethnopharmacology, 1987, 21: 45-53

[2] 王国佐. 血清药理学方法在中药研究中的进展[J]. 湖南中医药大学学报, 2007, 27 (3): 78-80

[3] 孙敬方. 动物实验方法学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2001: 110-126

[4] 张开镐. 依赖性药物药理效应的种属差异[J]. 中国药物依赖性杂志, 2010, 19 (5): 413-415

[5] 王力倩, 李仪奎, 符胜光, 等. 血清药理学方法研究探索[J]. 中药药理与临床, 1997, 13

(3): 29-31

[6] 杨奎, 周明眉, 姜远平, 等. 中药血清药理学的方法学研究---给药方案的研究[J]. 中药药理与临床, 1999, 15 (3): 43-44

[7] 康敏, 王仁生,刘文其, 等. 血清药理实验方法学在抗鼻咽癌中药筛选中的应用[J]. 临床医学工程, 2013, 20 (1): 16-18

[8] 陈晓白, 王晓平, 赵仕花. 毛鸡骨草含药血清体外抗乙型肝炎病毒作用的研究[J]. 中国实验方剂学杂志, 2012, 18 (22): 218-221

[9] 董淼伟. 时辰药理学与临床合理用药[J]. 人民军医, 2008, 51 (4): 241-243

[10] 柯玮, 朱建华. 中药血清药理方法学的研究概况[J]. 中国医药指南, 2011, 9 (6): 24-25

[11] 陈一江, 章艳茹. 血清药理学方法研究温心汤对离体蛙心收缩活动的影响[J]. 中国中医急症, 2010,19 (11): 1911-1913

[12] 陈赐慧, 花宝金. 关于中药血清药理学实验的几个问题和探讨[J]. 中华中医药学刊, 2013, 31 (1): 46-48

[13] 韩俭, 于红娟, 吴勇杰, 等. 中药血清药理学方法学研究---抗菌试验含药血清处理方案的研究[J]. 中药药理与临床, 2002, 18 (1): 47-48

[14] 周明眉, 杨奎, 姜远平, 等. 中药血清药理学的方法学研究---含药血清低温保存和血清灭活的影响[J]. 中药药理与临床, 1999 (2) : 45-47

[15] 詹红生, 赵咏芳, 冯伟, 等. 含药血清方法在中药调节骨与软骨代谢基础研究中的应用

[J]. 中国骨伤, 2000, 13 (11): 661-662

[16] 王霖, 张云, 汪受传. 中药血清药理学研究中含药血清添加量问题的商榷[J]. 山西中医, 2006, 22 (1): 51-52

[17] 冯文茹, 赵秀梅, 沈洪昇, 等. 中药方剂体内及含药血清抗肿瘤作用的比较[J]. 中华中医药学刊, 2009, 27 (6): 1230-1232

[18] 葛金文, 朱惠斌, 王宇红, 等. 关于中药血清药理学方法的再思考[J]. 世界科学技术---中医药现代化, 2008, 10 (6) : 16-22

[19] 罗琳, 窦志华, 丁安伟, 等. 大鼠灌胃复方五仁醇胶囊后血清和血浆中五昧子醇甲和五味子乙素的比较[J]. 中草药, 2006, 37 (10): 1486-1489

第二篇：中药血清药理学研究概述

万

方数据　

。等理处白蛋去的清血药含基，的响究研影学的理理药清处血活是究灭研及化存范规保的温术技备制清血药含题问化范规的术技备制清血药含１．３语结．１３．—．４５．８６９６２５２—－５：－—４３４。６５），法２：．：３方１８）２算（—６９）９（计９３５１０：１（的２１），９５；度（，，３，浓８社５９药。９９９９７１—９版１血１６，１；９９，）效技２（１出４，９科志等８，９９药１，１中籍志杂医杂志验，学中剂医古方国实验杂实中中国外医床中．．合体］北］口Ｊ讨中［探

四川解剖学杂志２００６年第１４卷第４期?３５?

＿—＿＿＿●——●●＿＿—－——＿＿——－●—●＿＿＿＿——＿＿＿—＿＿——＿—＿＿＿■－—＿＿＿—●—－——＿—●●＿—＿＿＿＿—＿——－＿＿－—●————●——＿＿—■●＿＿＿＿●——■——＿＿—■■■＿＿＿＿■—●■—一学方法学方面的一些问题已经初步得到解决并日趋规范生的内生性有效成分。这些成分可以是抗体、补体、细胞因

子、激素、酶、多肽、蛋白质等物质，经过灭活，可能使这些具有

药理活性的内生性有效成分失活而失去或减少其原有疗效。

对含药血清的预处理通常有３种方法。（１）丙酮法：向血

清内加入４～５倍量丙酮，混匀，于３０００ｒ／ｍｉｎ离心，取上清液

温水浴上蒸发，除去丙酮；（２）乙醇法：向血清内加入４～５倍

化阁。中药复方血清药理学技术方法的规范化研究主要包括９５％乙醇，混匀，于３０００ｒ／ｍｉｎ离心，取上清液温水浴上蒸发，

面。除去乙醇；（３）加温法：５６℃水浴上放置３０ｅｍｉｎ。这３种方法

主要去除了血清中的大部分蛋白质、糖及部分电解质，血清的

正常生物活性基本丧失，容易突出血清中中药的作用。

选取的动物应结合具体的试验而定，一般多选用大鼠、家２）在体外反应系统中适当的增加血清添加量是可以的，兔、豚鼠等动物来制备含药血清。不同种属的动物，其血清成如果选择种属较接近的动物血清，甚至可以加到１００％的浓分不同，因此在选择动物时应尽量选用与人类生物学活性近度，即在纯血清内培养。但同时也要指出，由于培养基中多含似的物种。在实验中一般可采用成年大鼠（体重为２５０～３００３．ｉ．１动物的选择有较多营养物质以及含药血清细胞毒性作用，并不是所有的ｇ），并将数只大鼠的血清消混合，这样既能适应实验的需要，培养系中均可添加高浓度的血清。周明眉［１１］研究发现，含药也减少了动物的个体差异［９］。血清反应体系中的稀释浓度以１：４较好。因此，建议在正式３．１．２动物给药方案试验之前进行该实验体系中被培养细胞的血清最大耐受性观

１）给药剂量察，以确定血清的添加量。

在进行血清药理学实验前，必须确定合适的给药剂量。３．２血清药理试验作用效应一蠢ｌｊ量关系

王力倩等［１０］在研究苦参、仙鹤草的抗癌作用时发现，以参考公这部分内容包括研究体外反应体系中含中药血清加入的式（给药剂量＝临床常用量×动物等效面积系数×培养基内

血清稀释度）计算给药剂量得到的含药血清对肿瘤细胞体外

生长有抑制作用，而比以上述的参考公式计算的给药量小１

倍的含药血清无明显作用。李仪奎口ｕ提出两种方法：（１）增大通过几十年来科研工作者的不懈努力，血清药理学已发给药剂量；（２）血清冻于粉法。笔者认为，究竟采取什么剂量，

最好通过预试验解决，如能通过上述公式达到较好的阳性结

果，则应首先采用；反之，可继续增大给药量，只要动物不死

亡；如仍无阳性结果，可采用血清冻干法。助于促进中药药理现代化的发展。但对于中药复方体外药理

２）给药次数与时间间隔研究来说，复方提取物直接添加和制成含药血清间接添加各有７～ｌｏ天法（１次／天，连用７～１０天），３次给药法（连有优缺点。在实验研究中如把二者紧密结合起来，不仅能够续给药３次，第１、２次间隔２小时；第２，３次间隔４小时），２揭示中药制剂在胃肠内处理过程中活性成分的转化与改变，次给药法（第１次给药后２小时，再以相同剂量重复１次）等。而且有利于中药真正有效活性部位、有效成分的发现，为新药各种给药方式都是为了达到稳态血药浓度，从而便于药物作开发奠定基础。

用机理的研究。究竟采取什么方案，要视药物的Ｔ，／ｚ等药动爹芍又献学指标而定，最好是每隔１个半衰期给药１次，连续给４～６［１］Ｈｔｉｏｋｏ１ｗａｍａ，ＳｅｋａｅＡｍａｇａｙａ，ＹｕｋｉｏＯｇｉｈａｒａ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｓｈｏ’次，即可达到最大血药浓度，连续５～７个半衰期可达到稳态ｓａｉｋｏｔｏ，ａＪａｐａｎｅｓｅａｎｄＣｈｉｎｅｓｅｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎａｌｍｉｘｔｕｒｅＯｎｔｈｅｍｉ—血药浓度，但由于中药及其复方成分复杂，半衰期很难测定，ｔｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｏｃｈａｒｉｄｅ，ａｎｅｗｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｔｅｓ。所以７～ｌｏ天给药方案是比较保险的给药方法。如果对药物ｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．ＪＥｔｈｎｏｈｐｅｒｍａｅｏｌ，１９８７，２１（１）：４５—５３．

血清时效关系进行研究，则应另当别论。［２］张绪富，吕志平，赵进军．血清药理学在抗肝纤维化研究中的应用３．ｉ．３含药血清的采集概况口］．南京中医药大学学报（自然科学版），２００２，３（１８）：１２７—

理想的采血时间应在血药浓度的高峰期。目前对采血时１２８．

间尚无一个成熟的方法来参考。因为动物给药后，不同药物（３３薛岚．近年中药药理研究进展［Ｊ］．中药药理与临床，２０００，１６（１）：的浓度达峰时间不同，且同一药物的不同指标有其不同的最４６—４８．

佳采血时间。因此，规定统一的最佳采血时间似乎很难。根［４］许沛虎，杨敲群．中药血清药理学研究方法应用现状及展望［Ｊ］．湖据文献记载，９６个药物的达峰时间，＜１小时有４２个，１～２小

时有４６个，＞２小时有８个，选择在给药后１～２４＂ｍ，１采血是Ｅ５］Ｉ力倩，李仪奎等。血清药理学方法研究探索［Ｊ］．中药药理与临相对合理的。但同时还须注意，在这一时间采血，会有相当一［６］王力倩．用血清药理学方法研究中药苦参、仙鹤革的抗肿瘤作用部分药物成分的血药峰浓度已过或是尚未达到∽ｊ。

３．１．４含药血清的处理应用（７３谢锦玉．现代细胞化学技术及其在中西医药中的应用Ｍ］．北京，

１）血清灭活是含药血清制备技术规范化研究中需要解决

的问题之一。血清中含有许多酶、抗体、补体、细胞因子及其［８］刘成海，刘平，刘成等．抗肝纤维化有效中药复方血清药理学方法它生物活性物质，它们对体外培养的细胞、病毒、病原菌以及

王宁生，雷燕，刘平等．关于血清药理学的思考口］．中国中西医结

［１０３李仪奎．中药血清药理学实验方法的若干问题口］．中药新药与临

床药理，１９９９，１０（２）：９５—９８．

［１１］周明眉，杨奎，姜远平等．中药血清药理学的方法研究——反应体

系中含药血清加入量的研究［Ｊ］．中药药理与临床，１９９８，１４（６）：４３—４４

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