生物化学实验简答题

1 简述透析的原理，影响透析的因素及透析的应用。

透析是一种利用小分子能通过，大分子不能通过半透膜的原理把它们分开的一种重要手段。

影响透析的因素主要有膜、溶剂（水溶液、大分子溶液）、物理条件（温度、压力）、董南膜平衡等。 透析主要用于将大分子物质和小分子物质分开，如蛋白质的分离纯化。

2 请设计一项实验，分离并鉴定某一微生物中的游离氨基酸。

如何分析未知样品的氨基酸成分？

利用纸层析法分离鉴定该微生物中的游离氨基酸。

实验所需器材包括层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿和层析滤纸，实验所需试剂包括扩展剂、氨基酸溶液（各标准氨基酸溶液和待测氨基酸溶液）和显色液（0.1%水合茚三酮正丁醇溶液）。

实验操作步骤如下

一 取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘1.5-2cm处用铅笔划一条直线，在此直线上以相同间距作出记号。

二 点样 用毛细血管将各氨基酸样品分别点在所作记号的位置上，待干燥后，可重复点3次。

三 扩展 用线将滤纸缝成筒状，将滤纸直立于盛有扩展剂的培养皿中扩展。待溶剂上升至距滤纸上端边缘1cm时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界限，自然干燥或吹风机热风吹干。

四 显色 用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，用热风吹干显出层析斑点。

五 计算各氨基酸Rf值。

滤纸上的层析斑点图即是对氨基酸分离的结果，通过比较各标准氨基酸Rf值和待测氨基酸的Rf值即可鉴别待测的游离氨基酸。

3 层析技术包括哪几类？请简要介绍凝胶层析的原理。

层析技术包括吸附层析、离子交换层析、分配层析、薄层层析、凝胶层析和亲和层析。

凝胶层析的基本原理是用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物质分离。固定相是凝胶，各组分分子的大小不同，而在凝胶上受阻的程度不同，从而分层。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，移动速度快，先被洗出层析柱；小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱。 4 简述测定氨基酸含量的原理及注意事项。

甲醛滴定法

注意事项：

1 标准NaOH溶液应在使用前标定，并在密封瓶中保存，不可使用隔日贮存在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。

2 中性甲醛应在临用前配制，若已放置一段时间，使用前应重新中和。

3 本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作案分析化学要求进行。

5 核酸的检测方法有哪些？并简述各个方法的原理。

一 定磷法

RNA 和DNA中都含有磷酸，根据元素分析获知RNA的平均含磷量为9.4%，DNA的平均含磷量为

9.9%。因此，可从样品中测得样品中的含磷量来计算RNA 或DNA的含量。

用强酸将核酸样品消化，使核酸分子中的有机酸转变为无机酸，无机酸与钼酸生成磷钼酸，磷钼酸在还原剂作用下生成钼蓝。可用比色法测定样品中的含磷量。

二 定糖法

RNA含有核糖，DNA含有脱氧核糖，根据这两种糖的颜色反应可对RNA 和DNA进行定性和定量测定。

RNA分子中的核糖与浓盐酸或浓硫酸作用脱水生成糠醛，糠醛与某些酚类化合物缩合而生成有色化合物。如糠醛与3,5-二羟甲苯反应生成深绿色化合物，反应产物在660nm有最大吸收，并且与RNA的浓度成正比。

DNA分子中的脱氧核糖和浓硫酸作用，脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺反应生成蓝色化合物。反应产物在595nm有最大吸收，并且与DNA的浓度成正比。

三 紫外吸收法

核酸组分嘌呤环、嘧啶环具有紫外吸收的特性。用这种方法在测定核酸含量时，通常规定在260nm，测得样品RNA 或DNA溶液的A260值，即可计算出样品中核算含量。

6 请列举出2种以上将蛋白质和小分子物质分开的方法，并对其原理进行简要说明。

一 透析法 透析法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与其他小分子物质分开。

二 超滤法 其原理是利用超滤膜在一定的压力或离心力的作用下，大分子物质被截留而小分子物质则过滤排出。

三 分子排阻层析 其原理是利用蛋白质分子量的差异，通过具有分子筛性质的凝胶而被分离。

四 密度梯度离心 蛋白质颗粒的沉降速度取决于它的大小和密度。当其在具有密度梯度的介质中离心 1

时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停滞不前，可分步收集进行分析。

7 纸层析、柱层析和薄层层析各有什么特点？

纸层析是一种以滤纸作为支持物的分配层析法。组成滤纸的纤维素是亲水物质，能形水相和展层溶剂的两相系统，被分离的物质在两相中的分配保持平衡关系。纸层析法用于分析简单的混合物时可作单向层析，对于复杂的混合物，可作双向层析。

柱层析则是将固定相装在柱管内，以液体作为流动相，流动相带着样品在柱内由上往下移动而使混合组分分离，即使样品沿一个方向移动而分离。

薄层层析是在玻璃片、金属箔或塑料片上铺上一层约1~2mm的支持物，如纤维素、离子交换剂、硅胶、氧化铝或聚酰胺等，根据需要做不同类型的层析。薄层层析是一一种微量快速的层析方法，它较纸层析的优越在于分辨率高，层析时间短。

8 酶的Km值是否可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？米氏常数Km在实际应用中有何意义？

可以，因为Km值对某一个特定酶来说是个常数，只与酶的性质、酶催化的底物和酶促反应条件（如温度、有无抑制剂）等有关。酶的种类不同，Km值不相同；同一种酶与不同的底物作用时，Km值也不相同。

米氏常数Km在实际应用中的意义有：

一 反映酶的种类

二 反映酶与底物的亲和力

一般用1/Km近似地表示酶对底物亲活力的大小，1/Km越大，表示酶对该底物亲活力越大，酶促反应易于进行。

三 计算底物浓度和相对速度

四 识别反应激活剂或抑制剂的存在

9 试述实验中测定米氏常数(Km)的原理和方法。

酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示：

V[S]

v=————

Km+[S]

式中：υ为反应初速度；V为最大反应速度； [S]为底物浓度； Km 为米氏常数，其单位为摩尔浓度。 Km 值是酶的一个特征性常数，一般说来， Km 可以近似地表示酶与底物的亲和力。

双倒数作图法是测定 Km 值的最常用的方法，将米氏方程改写成倒数形式：

1 Km 1 1

—= —— (——) + ——

v V [S] V

实验时选择不同的[S] ，测定相对应的 V 。求出两者的倒数，以1 /υ对1/[S]作图，则得到一斜率为“Km / V”的直线。将直线外推与横轴相交，其横轴截矩为-1/[S]=1/V由此求出 Km 值。

在实验过程中，我们需在不同底物浓度下进行酶促反应，并根据反应特点以相应的方法判定酶促反应的初速度。如在胰蛋白酶消化酪蛋白的实验中，蛋白质水解生成自由氨基，可用甲醛滴定法判断氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。

10 简述脂肪酸的β-氧化的原理。

脂肪酸的氧化分解是在脂肪酰基的β-碳原子上发生的，每进行一次，断裂两个碳原子，故称之为β-氧化。在线粒体基质中，脂酰CoA在脂肪酸β-氧化多酶复合体的催化下，从脂酰基β-碳原子开始，过程包括脱氢、加水、再脱氢、硫解4个连续反应。经过一次β-氧化产生比原来少2个碳原子的脂酰CoA，如此反复进行β-氧化，最终可完全氧化为乙酰CoA。两分子乙酰辅酶A可再缩合成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β-羟丁酸。

11 抽滤和过滤操作应该有哪些注意事项？

过滤操作的注意事项：

过滤时，漏斗应放在漏斗架上，其漏斗柄下端要紧贴承接容器内壁，滤纸应紧贴漏斗内壁，滤纸边缘应低于漏斗边缘5mm，事先用蒸馏水润湿使不残留气泡。

倾入分离物时，要沿玻璃棒引流入漏斗，玻璃棒与滤纸三层处紧贴，分离物的液面要低于滤纸边缘。 漏斗内的沉淀物不得超过滤纸的高度，便于过滤后洗涤沉淀。

漏斗不能直火加热。若需趁热过滤时，应将漏斗置于金属加热夹套中进行。若无金属夹套，可事先把漏斗用热水浸泡预热方可使用。

抽滤操作的注意事项：

（1）使用布氏漏斗进行减压过滤时，要在漏斗底上平放一张比漏斗内径略小的圆形滤纸，使底上细孔被全部盖住。事先用蒸馏水润湿，特别要注意滤纸边缘与底部贴紧。

（2）布氏漏斗要用一个大小相宜的单孔橡胶塞紧套在漏斗颈上与配套使用的吸滤瓶相连。

（3）安装时，布氏漏斗的颈的斜口要远离且面向吸滤瓶的抽气嘴，抽滤速度要慢且均匀，滤液不能超过抽气嘴。

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（4）在抽滤过程中，若漏斗内沉淀物有裂纹时，要用玻璃棒及时压紧消除，以保证吸滤瓶的低压，便于吸滤。

12 简述离心机的使用方法及注意事项

离心机的使用方法：

1 将离心机安装在坚实的水平桌面上，安装合适的离心转子。

2 将离心样品称量平衡后，对称放入转子中，盖严离心机盖。

3 接通电源，打开开关

4 按“设置”键，用“▲”或“▼”键选择与转子匹配的转子号，按“ENTER”键确认。

5 按“设置”键，用“▲”或“▼”键选择所需转速，按“ENTER”键确认。

6 按“设置”键，用“▲”或“▼”键选择所需离心时间，按“ENTER”键确认。

7 按下“启动”键，离心机开始工作。

8 待离心机转速显示为“0”后，取出离心管，将转子擦拭干净，切断电源。

离心机使用的注意事项：

1 离心机应水平放置，保持良好的通风环境，避免阳光和热源直接照射

2 禁止离心机不加转子空转且确认转子是否放稳。一定要选择适宜的转子。

3 离心管要对称放置，离心样品在离心前一定要平衡。

4 离心机工作前一定要检查离心机盖是否盖严。

5 在使用过程中，若发现声音不正常，应立即停机。

6 长期不使用，应将转子取下擦拭涂油并妥善保管。

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第二篇：生物化学实验指导(最新修改)

实验一 糖的颜色反应

一 实验目的及要求

1. 掌握莫式（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。

2. 掌握塞式（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。

3. 掌握杜式(Tollen)试验鉴定酮糖的原理和方法。

二 实验原理

1．莫式试验：糖经无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与а-萘酚生成紫红色缩合物。

2．塞式试验：酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕红色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。

3．杜式试验：戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质。

三 实验仪器及试剂

仪器：水浴锅。

器皿：吸管、试管。

实验药品：蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、а-萘酚、浓硫酸、95%乙醇、间苯二酚、盐酸、间苯三酚。

实验试剂：

莫式试剂：а-萘酚5g,溶于95%乙醇并稀释至100ml。现用现配，并贮于棕色试剂瓶中。 塞式试剂：间苯二酚50mg，溶于100ml盐酸（VH2O：VHCl=2:1），现用现配。

杜式试剂：2%间苯三酚乙醇溶液（2g间苯三酚溶于100ml95%乙醇中）3ml,缓缓加入浓盐酸15ml及蒸馏水9ml。临用时配制。

四 实验内容及步骤

一、莫式实验

于4支试管中，分别加入1 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1 ml水中），然后各加莫式试剂2滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5 ml（切勿振摇！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。

二、塞式试验

于4支试管中，分别加入0.5 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加塞式试剂2.5ml，摇匀，同时置沸水浴内，比较各管颜色及红色出现的先后顺序。

三、杜式试验

于3支试管中加入杜式试剂1ml，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。将试管同时放入沸水浴中，观察颜色的变化，并记录颜色变化的时间。

五 实验现象记录

仔细观察实验中的颜色变化，对于塞式试验和杜式试验还需记录下颜色变化的时间

实验二 直接滴定法测定- 葡萄酒、果酒－总糖和还原糖

（参考国标 GB T15038-94）

1 范围

本方法适用于葡萄酒、果酒及其相关产品中总糖和还原糖含量的测定。

2 原理

还原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的单糖和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。在碱性溶液中，还原糖能将Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金属离子还原，而糖本身

被氧化成糖酸及其他产物。糖类的这种性质常被用于糖的定性和定量测定。

本实验采用费林试剂热滴定法。费林试剂由甲、乙两种溶液组成。甲液含硫酸铜和亚甲基蓝（氧化还原指示剂）；乙液含氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。将一定量的甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：2NaOH + CuSO4 = Cu(OH)2+ Na2SO4在碱性溶液中，所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的络合物酒石酸钾钠铜：

在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀，其反应如下：

反应生成的氧化亚铜沉淀与费林试剂中的亚铁氰化钾（黄血盐）反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点。 Cu2O + K4Fe(CN)6 + H2O

Fe(CN)6 + 2KOH

滴定时以亚甲基蓝为氧化－还原指示剂。因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜离子全部被还原后，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算出还原糖含量。

3 试剂

3.1 盐酸溶液（V HCl:H2O 1:1）；

3.2 氢氧化钠溶液200g/L；

3.3 标准葡萄糖溶液2.5g/L：精确称取2.5000g（称准至0.0001g）在105～110℃烘箱内烘干3h并在干燥器中冷却的葡萄糖，用水溶解定容至1000mL。

3.4 次甲基蓝指示液10g/L：称取1.0g次甲基蓝，溶解于水中，稀释至100mL。

3.5 斐林氏A、B 液

a.配制：斐林氏液A：称取分析纯硫酸铜（CuSO4•5H2O）69.28g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，放置1d，过滤，贮于棕色瓶中。斐林氏液B：称取分析纯氢氧化钠100g和分析纯酒石酸钾钠（KNaC4O6H4•4H2O）346g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，放置2d，用石棉垫抽滤。

b.标定预备试验：取斐林氏A、B 液各5.00mL于250mL三角瓶中，加10mL水摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积。

正式试验：准确吸取费林试剂甲液和乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL。从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值，按下式计算：

Cu2O + K4Fe(CN)6 + H2OK2Cu2

式中：F──10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL）相当于葡萄糖的量，mg； C──葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL；

V──标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。

样品糖的定量测定

(1) 样品溶液预测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要保持溶液呈沸腾状态。待溶液由蓝色变浅时，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。

(2) 样品溶液测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL，置于锥形瓶中，加蒸馏水10mL，加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少1mL的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值。

结果处理

其中：m──样品重量，g；

式中：F──10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL）相当于葡萄糖的量，mg； V──标定时平均消耗还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL；

V1──还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL；

1000──mg换算成g的系数。

注意事项

（1）费林试剂甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。

（2）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，

氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。

（3）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。

五 还原糖的计算

六 撰写实验报告及实验效果分析

实验三 蛋白质性质（一）——蛋白质及氨基酸的呈色反应

一 实验目的

学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。

二 实验原理

蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白质物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果来决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用蛋白质定性测定的依据。

双缩脲反应：将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故能呈此反应。

黄色反应：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为黄色的硝苯衍生物。

茚三酮反应：蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及α-氨基酸所共有。含氨基酸的其他物质亦呈此反应。

三 试剂及器材

实验器材：鸡蛋白、吸管、滴管、试管、水浴锅、电炉。

实验试剂：卵清蛋白、0.1%茚三酮、尿素、10%NaOH、浓硝酸、1%硫酸铜溶液。

四 内容

1. 双缩脲反应

（1）取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，释出的氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml摇匀，再加2滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。

（2）另取一支试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1% CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。

2. 黄色反应

于一试管内，加入蛋白质溶液10滴及浓硝酸3-4滴，加热，冷却后再加10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化。

3. 茚三酮反应

取1ml蛋白质溶液置于烧杯中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。

五 撰写实验报告及实验效果分析

实验四 蛋白质性质（二）——蛋白质等电点的测定和沉淀反应

一 实验目的

学习测定蛋白质等电点的方法；了解蛋白质变性与沉淀的关系。

二 实验原理

多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。

蛋白质盐析作用：向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。

乙醇沉淀蛋白质：乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质质点的水化层使其沉淀出来。

重金属盐沉淀蛋白质：蛋白质与重金属离子结合成不溶性盐类而沉淀。

三 试剂及器材

实验器材：试管、吸管、吸滤瓶、布式漏斗等。

实验试剂：蛋白质试液、硫酸铵结晶体、饱和硫酸铵溶液、95%乙醇、结晶氯化钠、1%醋酸铅、5%鞣酸溶液、1%硫酸铜溶液、饱和苦味酸溶液、1%醋酸溶液。

五 实验内容

一、蛋白质盐析作用

1. 取蛋白质溶液5ml，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合静置几分钟，球蛋白即析出。

2. 将上述混合液过滤，滤液中加硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察是否溶解。

二、乙醇沉淀蛋白质

取蛋白质溶液1ml，加晶体NaCl少许，待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀。观察有无沉淀析出。

三、重金属盐沉淀蛋白质

取试管2支，各加蛋白质2ml，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。

四、生物碱试剂沉淀蛋白质

取2支试管各加2ml蛋白质溶液及1%醋酸溶液4-5滴，向一支试管中加5%鞣酸溶液数滴，另一管内加饱和苦味酸溶液数滴，观察结果。

五 蛋白质等电点的测定（参考生物化学实验，化工出版社，董晓燕主编）

六 撰写实验报告及实验效果分析

实验五 蛋白质的制备——牛奶中提取酪蛋白

一 目的

掌握从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法，设计一种从鲜奶中提取酪蛋白的最佳方案。

二 原理

酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，占乳蛋白的80%-82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质可以检测牛乳中是否掺假。酪蛋白在其等电点（pH4.6）时由于静电荷为零，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调到pH4.6，酪蛋白就可从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白粗制品中将脂类杂质除去。

三 参考试剂及器材

温度计、布氏漏斗、pH试纸、抽滤瓶、水浴锅、烧杯、量筒、表面皿、天平、离心机。 市售全脂牛奶、无水乙醇、无水乙醚、pH4.7乙酸钠缓冲液0.2mol/L。

四 操作步骤（仅供参考）

1、酪蛋白等电点沉淀

将100mL牛乳放到500mL烧杯中，加热到40℃，加入到同样40℃的乙酸钠缓冲液中，调到pH4.7。此时有絮状的蛋白质沉淀析出。将悬浮液冷却至室温，放置分层 ，3000 r/min离心15 min，收集沉淀。

2、水洗

将pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍，洗涤粗制品三次，离心10分钟，得到沉淀蛋白。

3、去脂

向粗制品中加入10 ml无水乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中，用乙醚-乙醇混合液洗涤沉淀两次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。准确称重后，计算出每100mL牛 乳所制备出的酪蛋白质量（g/100 mL），并与理论产量（3.5g/100mL）相比较，求出实际获得百分率。

五 撰写实验报告及实验效果分析。

实验六 Bradford法测定蛋白质的含量

一 目的

掌握考马斯亮蓝G250染色法测定蛋白质的含量的原理及方法。

二 原理

考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0—1000ug/mg）蛋白质-染料结合物在波长595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质和考马斯亮蓝G250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

三 试剂及器材

实验器材：旋涡混合器、试管、吸管、722型分光光度计、容量瓶、量筒、电子分析天平。

实验试剂：（1）0.9%NaCl；（2）标准蛋白液:牛血清白蛋白（0.1 mg/ml）；（3）染液：考马斯亮蓝G250（0.01%），称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100 ml浓磷酸，加蒸馏水定容到1000 ml；（4）样品液：取牛血清白蛋白（0.1 mg/ml）溶液，用0.9%NaCl稀释至一定浓度。

四 实验内容

一、标准曲线的绘制

取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。 试剂

标准蛋白液/ml

考马斯亮蓝染液/ml

蛋白质浓度/（ug/ml）

A595 0 4.0 0 混匀，室温静置3 min，以第一管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度。

二、样液的测定

另取一干净试管，加入样品1.0 ml及考马斯亮蓝染液4.0 ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度。

三、数据记录和处理

根据标准溶液的吸光度，在坐标纸上绘制出浓度-吸光度曲线，测出未知液的吸光度后，在标准曲线上查出未知液的浓度。

五 撰写实验报告及实验效果分析

实验七 糖化酶活力的测定

一 目的

掌握糖化酶活力测定的原理与方法 ，设计一种测定粗酶中的最佳方案。

二 原理

糖化酶能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1, 4葡萄糖苷键生成葡萄糖.葡萄糖分子中含有醛基,能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,由此可计算酶活力。碘量法原理为在碱性介质(NaOH)中,碘歧化为次碘酸钠和碘化钠,次碘酸钠氧化溶液中游离的醛基为酸基.适当酸化,剩余的次碘酸钠与碘酸钠又生成碘,以淀粉为指示剂,用硫代硫酸钠标准溶液滴定.根据总碘量和硫代硫酸钠的用量,可对应获得甲醛的量.反应为:

I2+2OH-=OI-+I-+H2O

HCHO+OI-+OH-=HCOO-+I-+H2O

OI-+I-+2H+= I2+H2O

I2+2S2O32-=S4O62-+2I

三 供参考的仪器及试剂

1.溶液及试剂

乙酸-乙酸钠缓冲溶液，硫代硫酸钠标准溶液，碘溶液，氢氧化钠溶液，硫酸溶液，20g/l可溶性淀粉溶液，10g/l淀粉指示剂

2.器材

恒温水浴锅，滴定管架，碱式滴定管，秒表，比色管，碘量瓶，容量瓶等

四 方法步骤（仅供参考）

1. 标样酶液的制备

称取酶粉1～2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00ml），先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清夜小心倾入容量瓶中。沉淀部分再加入少量缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力在100～250u/ml范围内），摇匀。通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

2. 待测样品的制备

上清发酵液：培养96h的黑曲霉发酵液，8000rpm离心10min，取上清液备用。

酶泥：将浓缩干燥后的酶样滤纸剪成小片，取10ml乙酸缓冲液浸泡小滤纸片，制成酶泥。

3. 酶与底物反应

取甲、乙、丙、丁四支比色管，分别加入20g/L可溶行淀粉溶液25ml及pH4.6乙酸－乙酸钠5ml，摇匀后，于40℃恒温水浴锅中预热5min。

在甲管中加入待测酶液2ml（酶液从冰箱中取出，需预热2min），立刻摇匀；在乙管中加入离心发酵上清液2ml；在丙管中加入酶泥液2ml。在40℃下准确反应30min，立刻各加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2ml，摇匀，取出迅速冷却，并在丁管中补加待测酶液2ml,过程见下表： 管号\试剂

20g/L 可溶性淀

粉 甲 乙 丙 丁（空白） 5ml 5ml 5ml pH 4.6 缓冲液 摇匀，40℃预热5min

酶液 标样2ml 上清发酵液2ml酶泥反应时间℃ 30min

0.1mol/L NaOH

0.2ml 取出，迅速冷却

0 0 发酵上清液 0.2ml 0.2ml 0.2ml 补加酶液4. 测定

吸取上述甲、乙、丙管的反应液与丁对照管的空白液5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10ml，再加0.1mol/L氢氧化钠溶液15ml，摇匀，密塞，于暗处反应15min。 取出，加入2mol/L硫酸溶液2ml，摇匀；立即用0.05mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色，再加入1ml 10g/L淀粉指示液，继续滴定直至蓝色刚好消失为其终点。 注意记录硫代硫酸钠溶液滴定前、后的刻度。

五 结果分析

1.各瓶滴定，所用硫代硫酸钠情况如下表：

甲 乙 丁（空白）

滴定起始值（ml）滴定终点值（ml）滴定用量 （ml）4.3 17.5

酶活力

2.酶活力的计算公式

X＝(A-B)*C*90.05*(32.2/5)*(1/2)*n*2=579.9*(A-B)*C*n

A--------空白消耗硫代硫酸钠的体积(ml) B----样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积 C--------硫代硫酸钠标准溶液的浓度(mol/L)

90.05---与1ml硫代硫酸钠标准溶液(1mol/L)相当的以克表示的葡萄糖的质量 32.2-----反应的总体积(ml) 5---吸取反应液的体积(ml)

1/2-------吸取酶液2ml,换算成1ml n---稀释倍数

2---------反应30min，换算成1h的酶活力。

六 撰写实验报告及实验效果分析

实验八 酵母RNA的提取及定性和定量鉴定

一 目的

通过查阅核酸的相关鉴定方法后，各小组设计一种简单的核酸实验室鉴定方法。

二 原理

酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2％。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA制品。用碱液提取的RNA有不同程度的降解。

三 试剂（仅供参考）

干酵母粉（市售）、鲜酵母（市售）、pH试纸、电子天平、抽滤瓶500ml、布氏漏斗φ10cm、吸管、离心机。

0.2％氢氧化钠溶液：2g NaOH 溶于蒸馏水并稀释至1000ml。

乙酸、95％乙醇、无水乙醚、氨水。

10％硫酸溶液：浓硫酸（比重1.84）10ml，缓缓倾于水中，稀释至100ml。

5％硝酸银溶液：5g AgNO3 溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。

苔黑酚－三氯化铁试剂：将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mg

FeCl3·6H2O。临用时配制。

四 实验方法：（仅供参考）

1. RNA的提取

称取8g 干酵母粉于100ml 烧杯中，加入0.2％ NaOH溶液40ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。冷却，加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（pH5～6，用石蕊试纸试之），离心10～15分钟（4000r/min）。取上清液，加入2倍体积的95％乙醇，边加边搅。加毕，静置，待完全沉淀，过滤。滤渣先用95％乙醇洗2次（每次约10ml），继而用无水乙醚洗2次（每次10ml），洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可作鉴定和测定含量用。

2. 鉴定

取上述RNA约0.5g，加10％浓硫酸5ml，加热至沸1～2分钟，将RNA水解。①取水解液0.5ml，加苔黑酚－三氯化铁试剂1ml，加热至沸1min，观察颜色变化。②水解液2ml，加氨水2ml及5％硝酸银溶液1ml，观察是否产生絮状的嘌呤银化合物。

五 撰写实验报告及实验效果分析

附：RNA

实验目的

掌握用苔黑酚法测定RNA含量的原理和方法。

实验原理

在酸性条件下，RNA分子中的核糖基转变成α－呋喃甲醛，后者与苔黑酚作用生成绿色复合物，可用比色法测定。

当核糖核酸浓度在10～100μg/ml范围内，其浓度与吸光度呈线性关系。 的定量测定（苔黑酚法）

实验器材与试剂

1. 粗制RNA（上一个实验所得）、试管7支、吸管若干、分光光度计、水浴锅。

2. 标准RNA母液：准确称取RNA10.0mg，用少量蒸馏水溶解（如果不溶，可滴加浓氨水，调pH7.0），定容至10.0ml，此溶液浓度为1mg/ml。

标准RNA溶液：取母液1.0ml，置10ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。此溶液为100μgRNA/ml。

3. 样品溶液：将一定量的RNA粗品用蒸馏水溶解并定容，RNA浓度在10～100μg/ml 范围内。

4. 苔黑酚－三氯化铁试剂：参见上一个实验。

操作步骤

1. 标准曲线的绘制

取试管6支，按下表编号并加入试剂 试剂

RNA标准液/ml

蒸馏水/ml

苔黑酚试剂/ml

0 加毕，混匀，置沸水浴中加热45min，冷却，测定各管A670nm。以A670nm为纵坐标，RNA量（μg）为横坐标作图。

2. 样品的测定

取1.0ml样品液置试管内，加蒸馏水1.0ml及苔黑酚试剂2.0ml，沸水浴保温45min，冷却，测定其A670nm。根据标准曲线求得RNA的质量（μg）。

100％式中 ω：RNA的质量分数（％）；m1：样品液中测得的RNA的质量（μg）；m2：样品液中样品的质量（μg）。

实验九 酶的特性—底物专一性

目的要求

（1）了解酶的专一性。（2）学会排除干扰因素，设计酶学实验。

实验原理

酶的专一性是指一种酶只能对一种底物或一类底物（此类底物在结构上通常具有相同的化学键）起催化作用，对其他底物无催化反应。如淀粉酶只能催化淀粉水解，对蔗糖的水解并无催化作用。淀粉水解产物为葡萄糖，蔗糖水解产物为果糖及葡萄糖，这两种己糖的半缩醛基可与Benedict试剂反应，生成氧化亚铜的砖红色沉淀。

本实验以唾液淀粉酶（内含淀粉酶及少量麦芽糖酶）和蔗糖酶对淀粉及蔗糖的催化作用，观察酶的专一性。

试剂和器材

一、试剂

2%蔗糖；1%淀粉溶液（含0.3%氯化钠）。

本乃狄（Benedict）试剂：溶解85g柠檬酸钠和50gNa2CO3?2H2O于400mL蒸馏水中；另溶8.5g CuSO4?5H2O于50mL热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠－碳酸钠溶液中，边加边搅匀，如有沉淀可过滤除去，此试剂可长期保存。

二、材料

(1) 唾液淀粉酶溶液：先用蒸馏水漱口，再含10mL左右蒸馏水，轻轻漱动，约2分钟后吐出收集在烧杯中，即得清澈的唾液淀粉酶原液，根据酶活高低稀释50-100倍，即为唾液淀粉酶溶液。

(2) 蔗糖酶溶液：取1g干酵母放入研钵中，加入少量石英砂和水研磨，加50mL蒸馏水，静置片刻，过滤即得。

三、器材

试管1.5×15cm（×10），试管架；烧杯100mL（×1），200mL（×1）；量筒100mL（×1），10mL（×1）；玻璃漏斗；竹试管夹；水浴锅；。

操作方法

一、检查试剂

取3支试管，按下表操作：

操作项目

1%淀粉溶液(mL)

2%蔗糖溶液(mL)

蒸馏水(mL)

Benedict试剂(mL) 0 1 2 3 3 3 2 2 2

沸水浴煮沸2-3min

记录观察结果

二、淀粉酶的专一性

取3 支试管，按下表操作：

操作项目

唾液淀粉酶溶液(mL) 1 2 3 1 1 1 1%淀粉溶液(mL) 3 2%蔗糖溶液(mL) 3 蒸馏水(mL)

摇匀置37度水浴保温15min

Benedict试剂(mL) 2 2

0沸水浴煮沸2-3min

记录观察结果

三、蔗糖酶的专一性

取3 支试管，按下表操作：

操作项目 1 2 3 蔗糖酶溶液(mL) 1 1 1 1%淀粉溶液(mL) 3 2%蔗糖溶液(mL) 3 蒸馏水(mL)

摇匀置37度水浴保温15min

Benedict试剂(mL) 2 2 2

沸水浴煮沸2-3min

记录观察结果

思考题

? 观察酶专一性试验为什么要设计这3组实验？每组各有什么意义？ ? 请写出淀粉类型，结构和蔗糖的结构式？ 3 2 3

实验十生化制品的理化指标检测

一 目的

本实验为学期结束时考核实验，目的是对学生自主设计实验综合能力的考核。

二 基本要求

要求学生自主设计实验方案、配置试剂、独立或团队协作完成，最终作为实验成绩考核依据。实验范畴为：生化制品的理化指标检测（蛋白、氨基酸、酶类、发酵制品等理化指标检测）

实验参考方法：

果酒理化指标检测原理与方法

1.1 酒精度

1.1.1 原理

以蒸馏法去除样品中的不挥发性物质，用密度瓶法测定馏出液的密度。根据馏出液（酒精水溶液）的密度，求得20℃时乙醇的体积分数，即酒精度，用%（体积分数）表示。

1.1.2方法

a) 用一洁净、干燥的100 m L容量瓶准确量取100 m L样品（液温20℃）于500m L蒸馏瓶中，用50m L水分三次冲洗容量瓶，洗液全部并入蒸馏瓶中，再加几颗玻璃珠，连接冷凝器，以取样用的原容量作接收器（外加冰浴）。开启冷却水，缓慢加热蒸馏。收集馏出液接近刻度，取下容量瓶，塞盖。于20.0±0.1℃水浴中保温30min,补加水至刻度，混匀，备用。

b) 将密度瓶洗净并干燥，带温度计和侧孔罩称量。重复干燥和称量，直至恒重（m）。 c) 取下温度计，将煮沸冷却至15℃左右的蒸馏水注满恒重的密度瓶，插上温度计，瓶中不得有气泡。将密度瓶浸入20.0±0.1℃的恒温水浴中，待内容物温度达20℃，并保持10min不变后，用滤纸吸去侧管溢出的液体，使侧管中的液面与侧管管口齐平，立即盖好侧孔罩，

。 取出密度瓶，用滤纸擦干瓶壁上的水，立即称量（m1）

d) 试样质量的测量

将密度瓶中的水倒出，用试样（2.1.1.3）反复冲洗密度瓶3次～5次，然后装满，称量。 （m2）

结果计算

样品在20℃时的密度按式（1）计算，空气浮力校正值按式（2）计算。

20=ρ20m2?m+A×ρ0 （1） m1?m+A

m1?m （2） 997.0A=ρμ×

式中：

20…………样品在20℃时的密度，单位为克每升（g/L）； ρ20

m …………密度瓶的质量，单位为克（g）；

m1……………20℃时密度瓶与水的质量，单位为克（g）；

m2……………20℃时密度瓶与试样的质量，单位为克（g）；

ρ0……………20℃时蒸馏水的密度（998.20 g/L）；

A ……………空气浮力校正值；

； ρμ……………干燥空气在20℃、1010.25hPa时的密度值（≈1.2 g/L）

997.0 …………在20℃时蒸馏水与干燥空气密度值之差，单位为单位为克每升（g/L）【22】；

1.2 总糖和还原糖

1.2.1 直接滴定法

1.2.1.1 原理

利用斐林溶液与还原糖共沸，生成氧化亚铜沉淀的反应，以次甲基蓝为指示液，以样品或经水解后的样品滴定煮沸的斐林溶液，达到终点时，稍微过量的还原糖将蓝色的次甲基蓝还原为无色，以示终点。根据样品消耗量求得总糖或还原糖的含量

1.2.1.2 方法

a) 斐林溶液（Ⅰ、Ⅱ）配制

按GB/T603配制。

b) 标定

预备试验：吸取斐林溶液Ⅰ、Ⅱ各5.00 m L于250m L三角瓶中，加水50m L，摇匀，在电热炉上加热至沸，在沸腾状态下用葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2滴次甲基蓝指示液，继续滴定至蓝色消失，记录消耗葡萄糖标准溶液的体积。

正式实验：吸取斐林溶液Ⅰ、Ⅱ各5.00m L于250m L三角瓶中，加50m L水和比预备试验少1m L的葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持2min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min内用葡萄糖标准溶液滴定至终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积（V）。

c) 计算

斐林溶液Ⅰ、Ⅱ各5m L相当于葡萄糖的克数按式（3）计算： 【23】。

F=m×V （3） 1000

式中：

F………斐林溶液Ⅰ、Ⅱ各5m L相当于葡萄糖的克数，单位为克（g）；

m………称取无水葡萄糖的质量，单位为克（g）；

V………消耗葡萄糖标准溶液的总体积，单位为毫升（m L）【24】；

d) 测总糖用试样

准确称取一定量的样品（V1）[液温20℃]于100 m L容量瓶中，使之所含总糖量为0.2g～0.4g，加5 m L盐酸溶液，加水至20 m L，摇匀。于（68±1）℃水浴上水解15min，取出，冷却。用氢氧化钠溶液中和至中性，调温至20℃，加水定容至刻度（V2），备用。 e) 测还原糖用试样

准确吸取一定量的样品（V1）[液温20℃]于100 m L容量瓶中，使之所含还原糖量为0.2g～0.4g，加水定容至刻度，备用。

以试样代替葡萄糖标准溶液，按2.2.1.2.1.2.5 b)同样操作，记录消耗试样的体积（V2），结果按式（4）计算。

测定干果酒或含糖量较低的半干果酒，先吸取一定量的样品（V5）[液温20℃]于预先装有斐林溶液Ⅰ、Ⅱ液各5.0m L的250m L三角瓶中，再用葡萄糖标准溶液按2.2.1.2.1.2.5 b)操作，记录消耗葡萄糖标准溶液的体积（V），结果按式（5）计算。

f) 结果计算

干果酒、半干果酒总糖或还原糖的含量按式（4）计算，其他类型按式（5）计算；

X1=F?c×V×1000 （4） V1×V32

F

V12×V3×1000 （5） X2=

X1………干酒、半干酒总糖或还原糖的含量，单位为克每升（g/L）；

X2………其他酒总糖或还原糖的含量，单位为克每升（g/L）；

V………消耗葡萄糖标准溶液的体积，单位为毫升（m L）；

V1………吸取样品的体积，单位为毫升（m L）；

V2………样品稀释后或水解定容的体积，单位为毫升（m L）；

V3………消耗试样的体积，单位为毫升（m L）；

F………斐林溶液Ⅰ、Ⅱ各5 m L相当于葡萄糖的克数，单位为克（g）；

c………葡萄糖标准溶液的体积，单位为克每升（g/m L）【25】；

1.3 总酸度

2.3.1 电位滴定法

1.3.1.1 原理

利用酸碱中和原理，用氢氧化钠标准滴定溶液直接滴定样品中的有机酸，以pH=8.2

为电位滴定终点，根据消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，计算试样的总酸含量。

2.3.1.2 方法

a) 吸取10.00m L烧杯中，加入50m L水，插入电极，放入一枚转子，置于电磁搅拌器上，开始搅拌，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定。开始时滴定速度可稍快，当样液pH=8.0后，放慢滴定速度，每次滴加半滴溶液直至pH=8.2为其滴定终点，记录消耗氢氧化钠滴定溶液的体积。同时做空白试验。

b) 结果计算 样品中总酸含量按式（7）计算：

X=c×(V1?V0)×75

V

2

X………样品中总酸的含量，单位为克每升（g/L）；

c………氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；

V0………空白试验消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（m L）；

V1………样品滴定时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（m L）；

V2………吸取样品的体积，单位为毫升（m L）；

75………柠檬酸的摩尔质量数值，单位为克每摩尔（g/mol） 6） （