实验一 清洗与灭菌
一、实验目的：能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
三、实验材料、用品
1．材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0．22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0．22 μm，过滤器(直径25)。
2．药品：70％或75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)。
3．仪器：超净台，干燥箱，高压蒸气灭菌锅，过滤器，过滤泵。
四、实验步骤
(一)清洗
1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。
2．使用过的玻璃器皿的清洗
(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。
(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。
(3)浸酸性洗液过夜。
(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗10．15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。
(5)包装(牛皮纸或一般纸)。
(6)高压(15磅20 min)或干热(170℃2 h)灭菌。
(7)贮存备用。
3．胶塞的处理
(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸lO-20 min。
(2)自来水清洗10次。
(3)再用1％稀盐酸浸泡30 min。
(4)自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。晾干，高压灭菌(见(二)消毒与灭菌)。旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。
（二）消毒
1．物理消毒法
(1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。
(2)干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160℃，保温90－120 min。用于RNA提取实验的用品则需180℃，保温5－8 h。
(3)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。
(4)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径20 mm、25 mm等)。滤膜孔径有0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm等，以0．22 μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。
2．化学消毒法
常用的消毒液有如下几种：
(1)70％(或75％)酒精：超净台里常备70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。
(2)0．1％新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有0．1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。
(3)来苏儿水(煤酚皂溶液)：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。
(4)0．5％过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。
(5)乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1—3 d。可将空气中漂浮的微生物杀死。
(6)37％甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37％甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。1—3 d后方可达到消毒空气的目的。
3．煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。
五、注意事项
1．清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10—15次。因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响下一次使用的效果。
2．干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。．
3．高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。
4．牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等)。
5．滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸)，包好，经高压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。
6．使用化学消毒法时，配制75％酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上
皮有严重的刺激和伤害作用。
实验二、原代培养
原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂 ：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒
实验步骤
1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法
1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。
2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。
3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。
4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
实验三、传代培养法
原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时
也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
实验材料与试剂
（1）材料： 原代培养细胞。
（2）设备与用品：倒置显微镜，CO2培养箱，超净工作台，高压灭菌锅，过滤器及0.22μm的水相滤膜，细胞培养瓶，移液管，吸管，小试管，酒精灯，试管架等。
（3）药品与试剂：RPMI-1640培养基；小牛血清； 0.25%胰蛋白酶（w/v, PBS缓冲液或D-Hanks缓冲液配制，pH7.4）。
? 强酸洗液的配制：先用约200mL蒸馏水充分加热溶解重铬酸钾63克，再缓缓加入1L浓硫酸并不断搅拌，充分混合溶解。洗液腐蚀性较强，操作时注意做好各方面的防护，并且动作要轻柔，注意安全。当洗液的颜色由棕红色变为绿色时表明已经失效，需重新配制。
4. 实验方法与步骤
? 实验内容：体外培养细胞的观察及细胞的传代培养。
（1） 培养基等的配制及实验用品的清洗与消毒
配制RPMI-1640培养基及0.25%胰蛋白酶（w/v, PBS缓冲液配制pH7.4）溶液，并过滤除菌后培养验菌。清洗，包装并高压灭菌细胞培养的玻璃用品等。细胞培养的玻璃器皿等进行初步清洗后要用强酸洗液浸泡过夜，然后用蒸馏水彻底冲洗干净；进行湿热灭菌时一般需至少灭菌40分钟；培养过污染细胞的培养瓶则最好加上用煤酚皂溶液浸泡过夜的步骤；移液管和吸管在包装前要在其管口用细丝或镊子塞上少许棉花，长约1~1.5cm，松紧要适宜。
（2）动物培养细胞的形态观察
倒置显微镜下观察培养细胞的长势及密度，根据细胞密度决定传代的稀释倍数。同时可对比观察教师事先准备的污染细胞、死亡细胞，并对培养细胞的密度有一定感性的认识。
（3）消化：倒掉旧培养基，加几滴胰酶润洗一下，立即倒掉，再加适量胰酶消化1~2分钟左右，可镜下观察待细胞胞质回缩，细胞间空隙变大时立即停止消化。
（4）悬浮细胞：沿着培养瓶无细胞的一面倒掉胰酶，加适量培养基，用吸管充分吹打后，镜下观察是否还有贴壁细胞。
（5）分装：一般以1：2或1：3进行分装，即一瓶细胞可传为2~3瓶。向分装好的各瓶细胞中再加入适量的含10%（v/v）血清的RMBI-1640培养液。
（6）拧上盖子（勿拧紧），做好标记，将培养瓶平放于培养箱中，于 37℃，5%CO2下培养。
5. 实验注意事项
（1）要保证实验中的无菌操作，就必须特别注意一些操作上的细节，比如：培养液等不要过早开瓶；加液时取液用的移液管、吸管勿碰用过的培养瓶瓶口；要勤过火焰，尤其是瓶口；手要握在移液器刻度之上的位置；超净台中物品的摆放要合理，尽量避免双手交叉取物；若有动作失误，勿存侥幸心理，应及时更换移液管等。
（2）对于贴壁细胞的传代培养胰酶的消化步骤是关键，要注意胰酶消化的时间也不能过长，否则不但造成细胞数目的损失，也会对细胞造成损伤，使细胞不易贴壁生长。
（3）可根据细胞的密度，生长速度及实验周期的要求等适当调整细胞的接种密度。但细胞若接种密度过低，也会造成细胞生长极为缓慢甚至停止生长。
第二篇：09动物细胞培养实验
实验一清洗与灭菌（4学时）
一、实验目的
能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理
清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
三、实验材料、用品
1．材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0．22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0．22 μm，过滤器(直径25)。
2．药品：70％或75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)。
3．仪器：超净台，干燥箱，高压蒸气灭菌锅，过滤器，过滤泵。
四、实验步骤
(一)清洗
1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。
2．使用过的玻璃器皿的清洗
(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。
(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。
(3)浸酸性洗液过夜。
(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗10．15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。
(5)包装(牛皮纸或一般纸)。
(6)高压(15磅20 min)或干热(170℃2 h)灭菌。
(7)贮存备用。
3．胶塞的处理
(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸lO-20 min。
(2)自来水清洗10次。
(3)再用1％稀盐酸浸泡30 min。
(4)自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。晾干，高压灭菌(见(二)消毒与灭菌)。旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。
（二）消毒
1．物理消毒法
(1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。
(2)干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160℃，保温90－120 min。用于RNA提取实验的用品则需180℃，保温5－8 h。
(3)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。
(4)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径20 mm、25 mm等)。滤膜孔径有0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm等，以0．22 μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。
2．化学消毒法
常用的消毒液有如下几种：
(1)70％(或75％)酒精：超净台里常备70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。
(2)0．1％新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有0．1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。
(3)来苏儿水(煤酚皂溶液)：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。
(4)0．5％过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。
(5)乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1—3 d。可将空气中漂浮的微生物杀死。
(6)37％甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37％甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。1—3 d后方可达到消毒空气的目的。
3．煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。
五、注意事项
1．清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10—15次。因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响下一次使用的效果。
2．干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。．
3．高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。
4．牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等)。
5．滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸)，包好，经高压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。
6．使用化学消毒法时，配制75％酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。
六、思考题
1．哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
2．紫外线消毒的适用范围和目的是什么?
实验二细胞形态观察（1学时）
一、实验目的
学习倒置显微镜的使用方法，观察体外培养细胞的形态及生长状况。
二、实验原理
倒置显微镜是组织培养实验中最重要的工具之一，将培养物放在显微镜的载物台上，打开电源，选择合适的镜头，聚焦于标本上，可以观察体外培养的细胞。
体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长。如羊水细胞为贴附型细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。
培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等，表明细胞代谢不良。
三、实验用品
1、器材
倒置显微镜、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔。
2、材料
贴壁细胞（sf9）、悬浮细胞（K562）
四、实验步骤
1．确保显微镜清洁（用70 ％乙醇擦拭载物台，如果有必要，用擦镜纸清洁物镜）。
2．打开电源，将灯光强度从最低开始，调至合适的强度，而不是直接打到强光。
3．检查光源与聚光器的连接
4．将相差环调至中央
5．检查细胞
( a ）记录生长状态（例如，稀少、亚汇合、汇合、细胞排列紧密）。
( b ）记录细胞状态（例如，清亮、透明或有颗粒、有空泡等）。
6．检查培养基的清亮程度（例如，无碎片、漂浮的颗粒、污染迹象等），根据需要选择一个放大倍数更高的物镜。
7．记录观察的结果。
8．旋低变阻器，关掉电源。
9．将培养液放回孵箱或放在超净台上。
五、注意事项
(1)观察体外培养细胞的几个问题；
细胞培养24h后，即可进行观察，观察的重点如下：
A.首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度
B.观察培养基颜色变化及细胞是否生长。
C.如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时可参照(2)的描述进行。
D．观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。
(2)细胞的生长阶段及其形态特征
传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。—般中层培养的细胞，从培养开始，经过生长、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将具分为5个时期，但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：
A．游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆形，折光率高，此期可延续数h。
B．吸附期(贴壁)：由于细胞的附壁持性，细胞悬液静置培养一段时间(约7—8h)后，便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。
C.繁殖期：培养l2h以后直到72h，细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到细胞铺满整个瓶壁(即所谓形成细胞单层)的过程。此期细胞形态为多角形(呈现上皮样细胞的特征)。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。
D．维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。
E．衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙，细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。
六、思 考 题
1．细胞培养获得成功的关键要素是什么?
2．简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。
实验三细胞计数及活力测定（1学时）
一、实验目的
学习细胞计数和活力测定方法
二、实验原理
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。
三、实验材料、用品
1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）
2、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇
3、材料：细胞悬液
四、实验步骤
（一）细胞计数
1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。
3、静置3分钟。
4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
（二）细胞活力
1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。
2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。
3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。
4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。
死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深蓝色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
实验四细胞的冻存与复苏（2学时）
一、实验目的
学习细胞冻存与复苏的基本方法
二、实验原理
在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
三、实验材料、用品
器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等
试剂：培养基、DMSO
附：冻存液配制：
培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。
四、操作步骤
（一）冻存
1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。
2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。
3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。
4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。
7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。
注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
（二）复苏
1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。
2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。
6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。
实验五小鼠肝脏、骨髓细胞原代培养(4学时)
一、实验目的
能独立地进行细胞的原代培养，争取原代培养一次成功。
二、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。
三、实验材料、用品
1、材料：培养瓶，青霉素瓶，小玻璃漏斗，三角烧瓶，平皿，吸管，试管，移液管，无菌纱布，无菌眼科剪，手术器械，4.5号头针，5ml一次性注射器、离心管。
8周小鼠，75％酒精棉球，2％碘酒。
2、药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清，0．125％胰蛋白酶，PBS液，75％酒精，双抗(青霉素和链霉素)。
3、仪器：CO2培养箱．；倒置显微镜，超净台，磁力搅拌器，离心机。
四、实验步骤
（一）肝脏细胞培养
1、将小白鼠引颈处死后于含有75%酒精的大烧杯中浸洗10秒钟。
2、用剪刀剪开小鼠腹部,迅速取出肝脏并将其放入装有4℃的含双抗的PBS 液中进行漂洗2次，之后在培养皿中用眼科剪子将鼠肝组织剪成1mm3 左右的小块, 放入试管中， 用吸管吹打, 待组织沉淀后吸出上清, 如此反复3 次,最后一次清洗后，将试管放入离心机800rp/min离心4min。
3、将离心后的试管取出后弃上清， 加入10倍肝组织体积的含0.2% Ⅳ型胶原酶和1%PVP的消化液后，封口，4℃冰箱过夜。
4、次日检查肝组织是否消化完全，消化完全者可用吸管吹打散开, 若消化不完全而吹打不开者,可重于37 ℃消化15min。
5、 将消化完全的悬液经200目不锈钢网过滤到培养皿中，之后将过滤后的悬液装到一个5ml离心管中，之后向过滤后的悬液中加入含10%新生牛血清的DMEM培养基到5ml, 于4℃冰箱中静置20min 。
6、用吸管弃除悬液, 加入DMEM培养基至5ml, 以1000 转/ 分离心4min , 弃上清，如此反复3 次。
7、最后离心完后再加入2ml含10%新生牛血清的DMEM完全培养基，收集肝细胞于培养瓶中，
于37℃、5%CO2条件下培养。
（二）骨髓细胞培养
1、小鼠脱臼处死后，75%乙醇浸泡5min后，在无菌操作台上分离双侧股骨及胫骨
2、在含生理盐水的玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端
3、用10ml注射器（配4.5号针头）抽取适量含10%FBS的完全培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。
4、依次用7号针头和4.5号针头（或依次过21、23、25号）反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液。
5、细胞悬液在1000rpm离心 5min后收集细胞，于37℃、5%CO2条件下培养。
五、思考题
1、如何提高原代细胞培养的成功率?
2、为克服微生物污染采取了哪些措施?
实验六 T淋巴细胞增殖实验（4学时）
一、实验目的
初步掌握从淋巴细胞功能及淋巴细胞转化试验的原理。
二、实验原理
正常机体的T淋巴细胞在体外培养过程中受到特异性抗原或有丝分裂原刺激。可转化为淋巴母细胞。细胞免疫缺陷时，患恶性肿瘤或某些其他疾病时，转化率显然降低。目前最常用植物血凝素（PHA）或刀豆蛋白A（ConA）作为分裂原来检测受试者的淋巴细胞转化率，从而判定其细胞免疫功能，称为淋巴细胞转化实验。
三、实验材料、用品
1．肝素（每毫升含100单位），PHA（每毫升含1000微克）。
2．199培养液（内含20%灭活小牛血清，青霉素100单位/毫升链霉素100微克/毫升）。
3. 无菌注射器及针头，试管，吸管。
四、实验步骤
方法1：
（1）提前三天给小鼠注射PHA0.5ml，6mg/kg ，一天一次，连续三天。
（2）剪断小鼠尾巴，往已准备好的载玻片上滴一滴血，推成血膜（头、体、尾分明）干燥，用瑞氏姬姆染液染色）镜检。
（3）计算淋巴细胞的转化率：油镜下观察每张玻片的头、体、尾三段。每段各一纵列（目的是减少推片中细胞分布不均的误差）。
方法2：
（1） 采肝素抗凝血1—2毫升（1毫升血中加肝素20单位）充分混匀。37℃静置1—2小时。红细胞沉淀后，吸取血浆层并捎带些红细胞。移入另一无菌试管中。计算白细胞数然后2000rpm离心10分钟。弃上清液。用199培养液将沉淀的白细胞配成1ⅹ107/毫升细胞悬液。
（2） 取细胞悬液0.6毫升（6ⅹ106细胞）加入含有2.4毫升199培养液的培养瓶中。
（3） 按每毫升营养液加30ugPHA加入PHA。
（4） 37℃孵育68—72小时。培养过程中，每天翻动培养瓶1-2次。
（5） 培养后。振荡培养瓶。将细胞重新悬起，然后移入试管中。
（6） 1000rpm离心5分钟。
（7） 尽量弃去上清液，将沉淀物混匀，取一滴放在载玻片上，推成血膜（头、体、尾分明）见图１，干燥，用瑞氏姬姆萨染液染色）镜检。
（8） 计算淋巴细胞的转化率：油镜下观察每张玻片的头、体、尾三段。每段各一纵列（目的是减少推片中细胞分布不均的误差）。
图１：血膜推片
每张玻片记数200～400个细胞，计算转化率其中头部50～100，体部50～100，尾部100～200细胞。
一般认为转化率的正常值为60～70%
淋巴细胞的转化标准
实验七细胞融合及单克隆化(8学时)
一、实验目的
掌握利用PGE法进行细胞融合的实验方法及细胞单克隆化的方法。
二、实验原理
真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)。人工的细胞融合开始于20世纪50年代, 60年代到70代作为一门新兴的技术, 发展非常快, 应用范围也极为广泛, 不仅同种类细胞间可以融合, 种间远缘细胞也能融合, 细胞与组织不同, 不排斥异类、异种细胞, 动物细胞如此，植物细胞也是如此。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon)；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。
利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起, 使两细胞的胞质沟通, 从而造成相互接触的细胞之间发生融合。
利用PEG介导细胞融合, 其融合效果受以下几种因素的影响。
1. PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。
2. PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。
3. PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。
4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细胞, 一般采用的温度为38~40℃。
三、实验材料、用品
（一）材料：新鲜鸡血。
（二）试剂：
1、Alsever液制备：
2、0.85%生理盐水液。
3、 GKN液：
4、50% PEG液 (现用现配)：
根据实验需要，称取适量PEG(Mr.4000)放入刻度离心管内，在酒精灯上将其加热熔化，待冷却至50℃，加入等体积的已预热至50℃的GKN液并充分混匀。
主要设备: 普通离心机、普通光学显微镜、水浴锅、塑料滴管、离心管等。
小型器材: 100ml 量筒2个, 滴管10支, 10ml 刻度离心管20支, 载、盖片各20片。
四、实验步骤
(一)细胞融合
1. 注射器内先吸入2ml Alsever液, 再从活鸡的翼下静脉抽取鸡血2ml，注入试管内, 再加入Alsever液6ml，使之成为1:4悬液，混匀后放在4℃冰箱中，可使用3~4天。
2. 取出上述悬液1ml加入 0.85%生理盐水4ml，混匀后，1200r/min离心5分钟，去上清液后，再以上述离心速率重复离心两次(5min, 10min)，以达到去除细胞表面粘附物质的目的。
3. 去除上清液后，将最后一次离心沉降的血球，加入适量GKN液，使之成10%的细胞悬液。
4. 取上述悬液，以血球计数法计数， 再用GKN液将红细胞的浓度稀释至3~4×104个/m3。
5. 取上述调整后的血球悬液1ml, 加入0.5ml 50%的PEG液混匀，吸取1~2滴, 滴到一干净的载玻片上，在常温下2~3min后即可加上盖玻片进行镜检，并计算出融合率。
经PEG处理后，在显微镜下，可观察到未融合的单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细胞。细胞的融合率指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞的核的总数与此视野内所有细胞的细胞核总数之比。可用如下公式表示：
融合率=视野内融合细胞的核数/视野内细胞的总核数×100%
在实验中统计融合率时, 要进行多个视野计数，然后再加以平均，以使计算更为准确。 本次实验共观察到两个视野有融合的细胞。如图所示：
通过计数，三个视野中有2/83 , 2/70，
计算得：该方法本实验中鸡红细胞融合率为：
（2+2）/（70+83）×100%=2.62%
（二）有限稀释法单克隆化融合的细胞
1．贴壁培养的细胞需要消化后计数，悬浮的细胞直接计数。
2．稀释细胞至每毫升10-100个细胞。
3．于96孔板上接种细胞，每孔100ul，于37 ℃ ，5 % CO2培养箱中培养，观察细胞克隆形成情况。
五、思考题
1、本实验中所用的PEG融合方法能否用于植物细胞？为什么？
2、本实验的材料为什么不用兔子或小鼠的血细胞？