一、实验目的
1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。
2、学习并掌握细胞传代培养的方法。
3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。
二、实验原理
细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。
动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。
传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
三、细胞培养相关设施及材料
1、细胞培养室
无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。
孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。
制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。
储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。
清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。
2、细胞培养常用基本设施：
荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。
细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。
3、细胞培养用品的清洗、消毒
新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗：
硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水；
冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。
所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工作台后打开包装。
消毒灭菌：高压蒸汽灭菌（120℃，20min）；紫外线消毒：主要用于实验室房间空气及操作台。
四、细胞培养用液及培养基
1、培养用液：水（高度纯净）；缓冲液：平衡盐溶液，维持渗透压，调节PH值，供给细胞生存所需能量和无机离子成分；消化液：胰蛋白酶液，EDTA，胶原酶等。
2、培养基：维持体外细胞培养生存和生长的溶液。
（1）天然培养基：血清（胎牛血清、小牛血清、马血清、兔血清、人血清等）、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）水解乳蛋白；
（2）合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成。如TC199、BME、MEM等。主要成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其他一些辅助物质。
五、动物细胞培养的条件
（1）无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外应定期更换培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。
（2）营养物质：无机物（无机盐、微量元素等），有机物（糖、氨基酸、促生长因等） 血清和血浆， 但血清和血浆不是营养物质。
（3）温度和PH：36.5±0.5℃，7.2-7.4。
所需要的特殊条件：
（4）血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在细胞培养中的主要功能：1)提供维持细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或量很少的营养物以及主要的低分子营养物等；
2)提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调整改变它们所结合的物质活力；
3)有些情况下其结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用；
4)新生牛血清是细胞贴壁、铺展在塑料、玻璃等培养基质上所需因子的来源；
5)构成缓冲系统，调节酸碱平衡；
6)提供蛋白酶抑制剂，在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害；
（5）支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃、塑料等作为支持物。
（6）气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件（95%的空气+5%的CO2混合气体），其中5%CO2气体是为保持培养液的PH稳定。
六、实验内容
1、用倒置荧光显微镜观察细胞形态
2、动物细胞传代
（1）培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代；
（2）准备好所需材料，先将手及超净工作台用酒精消毒，点燃酒精灯，将滴管用火焰烧，将PBS、培养基、胰酶准备好，要避免滴管交叉污染；
（3）将培养基喷酒精消毒，拿入超净工作台，用滴管把原有培养基吸掉；
（4）加入PBS吹洗培养皿（由于培养基中血清对胰酶消化有抑制作用，所以先用PBS洗），不要使劲吹，细胞贴壁不好，然后吸出PBS；
（5）加入适当的胰蛋白酶（使成单细胞悬液），消化30s，可快速在荧光显微镜下观察细胞形态，吸出胰酶；
（6）加入含有血清的培养基终止胰酶消化，用滴管吹打细胞，让细胞悬浮起来；
（7）根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中，一般癌细胞分5个，正常细胞传3个，放入孵箱继续培养；
（8）把超净工作台消毒收拾干净，将用过的滴管拿出超净工作台。
七、实验数据及分析
倒置荧光显微镜下HaCaT细胞形态
倒置荧光显微镜下A375细胞形态
HaCaT细胞为永生化人表皮细胞，来源于人皮肤，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生。传代用胰酶消化时，先用胰酶润洗，吸出后，孵育5min。
A375细胞为黑色素瘤细胞。
胰酶消化时，在倒置荧光显微镜下可观察到细胞变圆变亮，不再贴壁，成为单细胞。
八、实验注意事项
1、实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%乙醇擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%乙醇擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株的操作。
2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。验用品以70%乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3、小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4、实验人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。操作过程中小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。
5、定期检测下列项目：CO2钢瓶中CO2压力；CO2培养箱中CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）；无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000小时/HEPA）；定期更换水槽的水。
第二篇：细胞培养实验集合
实验一 培养基的配制及细胞培养的条件 一、 培养基的特性－细胞生存的环境与条件 1、 温度条件（37 0.5）
2、 pH条件 （7.2-7.4）
3、 气体条件
4、 水的质量（三蒸）
5、 渗透压
6、 营养条件
7、 无菌条件℃
二、 培养基的分类
1、 平衡盐液
2、 天然培养基（小牛血清、胚胎液） 3、 合成培养基（化学成分清楚） 三、 RPMI1640培养基的配制
1、RPMI1640 10 g 2、 丙酮酸钠 .0.11 g
3、 Hepes（羟乙基哌碃乙硫磺酸）4、 NaHCO3 2 g
5、 三蒸水 1000 mL
四、 过滤出菌 电磁搅
仪器：不锈钢正压滤器
材料：纤维素微孔虑膜 （0.22 mm 孔径）
装好后消毒
五、 完全培养基的配制
RPMI 1640 培养液 85 mL
小牛血清 10 mL
谷氨酰氨 1 mL
抗菌素（青、链霉素） 1万单位 1 mL
实验二 动物细胞培养
细胞培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。由于体外培养的细胞其结构和功能接近体内情况，便于使用各种技术和方法进行研究，并能在较长时间内直接观察细胞生长、发育、分化过程中的形态和功能变化，而且可同时提供大量生物学性状相似的细胞作为研究对象。所以细胞培养已经成为现代医学研究中一项非常重要的技术。
细胞培养不但是一门技术，也是一门科学，有它的基本理论、基本知识、和基本方法。
一、实验目的
1. 使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程；
2. 学习动物细胞原代培养和传代培养的基本方法，掌握动物细胞培养中的无菌操作技术，以及培养细胞的形态分类特点；
3. 以所培养细胞为材料，了解细胞冻存的几种简易方法并通过实验掌握其中的一种方法；
4. 以所培养细胞为材料，学习动物细胞融合的几种方法并掌握其中的一种方法。
二、实验条件
本实验在细胞工程实验室完成。
1、需要提供CO2培养箱，细胞融合仪，冷冻仪，研究用成像显微镜，体视成像显微镜，普通显微镜，生化培养箱，全自动高压灭菌锅，水浴锅，超声波清洗仪，超净工作台，真空泵，冷冻离心机，干燥箱，剪刀，镊子，液氮罐，纯水器，低温冰箱，普通冰箱等。
2、各种规格培养瓶、离心管，吸水纸，各种试剂瓶，培养皿
3、生化试剂：胰蛋白酶，胶元蛋白酶，M9培养基，DMEM，RPMI1640培养基，M199培养基，牛尾胶元，肝素，秋水仙素，PHA，小牛血清，青霉素，链霉素，EDTA，HEPES，Hanks液，Earle液，荧光染料，快绿，谷氨酰胺，聚乙二醇，
4、实验动物：小白鼠，兔子
三、实验要求
1、根据细胞工程理论课所学知识，就以上实验目的设计出实验方案（包括所选用材料、实验技术、方法）；
2、实验方案须交指导教师修改，然后开始实验；
3、实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。
4、设计实验方案前要多查阅文献资料，根据实际情况来选材、设计，尽量做到就地取材。
5、实验完成后，要认真分析实验结果，总结实验成败的因素，写出详细的实验报告。
四、实验说明
1、本实验的实验内容包括以下几点：1. 动物组织细胞形态观察与识别；2. 动物细胞的贴壁培养；3. 动物细胞的悬浮培养；4. 动物组织细胞的原代和传代培养；5. 动物细胞的冷冻保存；6. 动物细胞的融合。
2、要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，供给细胞存活所必须的条件，如：水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖、生长因子等，还要受到温度、渗透压等多种因素的影响。细胞培养用品的清洗、培养用液的配制、除菌等均有严格的要求，特别是无菌操作，是细胞培养成败的关键。
3、直接从生物体内获取细胞进行首次培养称为原代培养，当培养的细胞增殖达到一定密度后，需要做再培养，即将培养的细胞分散后，以一定的比率从一个容器转移到另一个容器中扩大培养，为传代培养。传代培养的累积次数就是细胞代数。
4、大多数细胞在体外培养时能贴附在支持物表面生长，称贴附型生长细胞，少数种类的细胞在培养时不贴附在支持物表面，而呈悬浮状态生长，称为悬浮型生长细胞。
5、在细胞培养过程中，细胞的传代及日常维持工作需要大量的耗费，而且随着传代次数的增加，体外培养细胞的生物特性会慢慢发生变化，因此需要对培养细胞进行及时的冻存，必要的时候在复苏。
6、两个以上细胞合并成一个双核或多核细胞，成为细胞融合。
五、注意事项
1、每班成立一个班长负责制的开放实验管理小组，成员为每小组的组长，负责安排相关同学配合教师完成以下工作：（1）实验前领取实验试剂和器具；（2）实验过程中实验室的水电、药品安全、仪器使用和登记情况、清洁卫生；（3实验完成后整理实验室。
2、实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。做到爱护仪器、节约材料和药品。实验完毕应及时清洁整理用过的实验仪器和用品。
六、思考题
1、简述体外培养细胞的生存条件。
2、在细胞培养中如何防止污染？
3、为什么培养细胞长成致密单层后要进行传代培养？
4、简述贴附型生长细胞和悬浮型生长细胞传代培养的主要方法和步骤。
5、进行细胞融合时要注意哪些问题？细胞融合率受哪些因素的影响？
6、冷冻过程中为什么要用慢速冷冻的方法？
实验三 动物细胞连续传代培养（SP2/0细胞）
一、实验目的：
1、为细胞融合准备SP2/0小鼠骨髓瘤细胞；
2、杂交瘤细胞的扩大培养（种腹水），或传代培养。
二、实验原理：
小鼠骨髓效力细胞株（NSI，SP2/0）和杂交瘤细胞均具有无限生长繁殖的能力，它们都属于半贴壁细胞，不用胰蛋白酶或EDTA消化液，只需轻轻冲洗瓶壁上的细胞便可脱落。因而可以利用这些特性对这类细胞进行连续传代培养，以为实验提供生长旺盛的细胞（对数生长期的细胞）。
三、实验材料：
SP2/0细胞（或杂交瘤细胞）
CO2培养箱、细胞培养瓶（25、50、100毫升）、弯头滴管、消毒用套筒（玻璃或铜质）、吸头、RPMI-1640完全培养基、倒置显微镜、试管架、酒精灯、灭菌高压锅。
四、实验步骤：
1、复苏的或转瓶的传代细胞，使细胞浓度大约为5×104/毫升，置37℃5%CO2培养箱中培养。
2、培养48小时后，可见部分细胞贴壁生长，而部分细胞呈漂浮状态，可用滴管吸去漂浮的细胞，加入少量新鲜培养基继续培养24小时以上。
3、若细胞生长过密，则需及时冲下并吸出部分细胞，或将吸出的细胞转瓶扩大培养，如果不是这样处理，细胞很易出现衰老、死亡现象，对于杂交瘤来讲，这样更易诱发阳性克隆丢失可能性。
4、用于细胞融合的骨髓细胞，必须在生长繁殖的对数期（约105细胞/毫升），而且细胞形态规则要一致（圆而亮，有一定的立体感），机能要活跃，活细胞数在90—95%以上。要得到这种细胞，其培养技巧在于，在融合前24小时，将生长良好的细胞全部自瓶壁冲下来，并除去1/2或更多的细胞，加入新鲜培养液令细胞重新贴壁分裂增繁。
5、作为长期在体外传代培养的细胞，为减少工作量，可采用8—10%小牛血清的培养基，这样细胞的繁殖速度亦慢，一般可间隔3天更换一次培养液。
6、本试验要求各组将细胞自小瓶转入中瓶再转入较大的培养瓶中生长，并用对数增长期的细胞用于冻存和复苏实验（见实验六）。
五、结果观察：
1、细胞传代前后的生长状态及速度的观察；
2、细胞转瓶后生长情况观察；
3、了解生长良好，一般及较差细胞的显微镜下观察；
4、传代细胞培养的体会。
六、注意事项：
1、连续细胞传代培养更应注意无菌操作；
2、传代时机对于细胞生长的状况及速度十分重要，尤其要注意不能等细胞出现老化后再传代，那样做一般结果并不如愿；
3、传代转瓶时细胞量的取舍主要根据细胞量的多少，生长条件优劣以及个人实践经验而决定；
4、用于冻存、融合、传代的细胞都要求是处于对数增长期的细胞，不能勉强 为之。
实验四——淋巴细胞杂交瘤的制备
一、实验目的
1、系统了解淋巴细胞杂交瘤实验技术的全部过程；
2、学会观察与判别融合细胞的出现，并计算融合率。
二、实验原理：
小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖。经过用某种抗原免疫的小鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的B淋巴细胞在一般培养某中不易存活。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的B淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，在HAT选择培养基中可以选择得到杂交细胞。这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某B淋巴细胞产物——单克隆抗体。
三、实验材料：
免疫的BALB/小鼠，SP2/O骨髓瘤细胞株，CO2培养箱 超净工作台
倒置显微镜
光学显微镜
恒温水箱
计数板、计数器、盖玻片；
离心机
手提式自封消毒锅
弯头滴管
吸量管（1.0、0、5.0毫升）
注射器（5毫升，10毫升）
针头（7#）
细胞培养瓶
24孔、96孔培养板（天津产或进口） 酒精灯
120目钢丝网
￠9cm平皿
50ml带盖塑料离心管
100毫升三角瓶、青毒素小瓶
烧杯（100，500，1000毫升）
微滤器1000毫升正压不锈钢滤器
微孔滤膜
眼科剪、镊
脱脂棉、纱布、胶布、卫生卷纸
HAT培养基
HT培养基
无血清培养基
15%小牛血清培养基
小牛血清
乙醇（AR，工业纯）
C—PBS
四、培养基与试剂的配制：
1、RPMI-1640培养基的配制；
RPMI-1640粉
丙酮酸钠
Hepes
三蒸水 10.4g 0.11g 5.925g 1000ml
磁力搅拦器搅拦3小时，溶解后过滤除菌，在4℃中保存。
2、200mML-谷氨酰胺的配制：
L-谷氨酰胺
三蒸水 1.461g 100ml
深解后，过滤除菌，分装小瓶，每瓶1ml，在-20℃保存。
4.5%碳酸氢钠（NaHCO3）配制
NaHCO3
三蒸水 5g 100ml
8磅高压灭菌15分钟，在4℃保存。如分装小瓶，每瓶4.2ml。
5、次黄嘌呤及胞腺嘧啶核苷（HT）100倍母液配制：
次黄嘌呤（Hypoxanthine，H）10—2m
68.05mg
胞腺嘧啶核苷（Thymidine,T）16×10-3m
19.4mg
三蒸水 50ml
在45—50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管中，每管1—5ml，在-20℃保存。
6、氨基碟呤（A）4×10-5m
1.76mg
三蒸水
90ml 0.5ml
IN氢氧化钠
溶解后，加入IN盐酸0.5ml中和，补充蒸馏水至100ml 过滤除菌，分装小试管内，每管1—5ml，在-20℃保存。
7、无血清RPMI-1640
100ml 1.0ml 1.0ml 4.2ml
L-谷氨酰胺200nM（0.2）
抗菌素（青、链霉素各1万单位） 5%碳酸氢钠
8、RPMI-1640完全培养基配制 RPMI-1640完全培养液
100ml 1.0ml 1.0ml 4.2ml 15ml
L-谷氨酰胺200mM（0.2m）
青、链霉素（各1万单位/ml） 5%碳酸钠
小牛血清（灭活）
9、HAT培养基的配制： RPMI-1640完全培养基 100倍HT母液 100倍A母液
10、HT培养基的配制 RPMI-1640完全培养基 100倍HT母液
11、50%（W/V）聚乙二醇（PEG）液的配制 PEG
10.0g
100ml
100ml 1.0ml 0.8ml
1.0ml
8磅15分钟，或煮沸20分钟灭菌并且融化，冷至50℃时加入。
RPMI-1640无血清培养基 10ml
混合均匀，分装小试管内，每管0.7ml，在-4℃中保存。
12、0.15MPH7.2枸橼酸钠-PBS配制：
NaCI
KCI
6.4g 0.16g 2.32g 0.16g 7.6g 1000ml NaHPO4·H2O KH2PO4 枸橼酸钠 二蒸水
分装在100ml瓶中，每瓶50—100ml，8磅15分钟高压灭菌后，在4℃保存。
13、20%二甲基亚矾（DMSO）细胞保存液的配制（按体积计算）： 小胎牛血清
5份 3份 2份 RPMI完全培养基 二甲基亚矾（DMAO）
混匀，在4℃保存，不必过滤除菌或高压清毒二甲亚矾，因它也是有毒的以至于自身是无菌的。
14、8-氮鸟嘌呤100倍母液的配制
8-氮鸟嘌呤 1
152mg 1.0ml 100ml 100ml 0.36%NaHCO2 4N NaOH 三蒸水
过滤除菌，分装小瓶，每瓶1.0ml，在-40℃保存。
15、0.1%伊文氏兰液配制：
伊文氏兰液（Fveng’s blue）
0.15M PH7.2枸楷酸钠-PBS 0.1g 100ml
混匀，4℃保存，也可配制成1%溶液，保存，使用前再稀释成0.1%。
五、实验步骤：
1、取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液，将108小鼠脾细胞与1-5×107SO2/O小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中，经1000转/分离心7分钟；
2、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；
3、将37℃水浴中保温的50%PEG1.0毫升（实际应用0.7毫升）用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37℃水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；
4、加完PEG后，将细胞悬液放在37℃水浴中静置90秒钟，立即在2—4分钟内加入15毫升无血清的RPMI-1640培养基（37℃），开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止作用。注意尽可能不搅动细胞；
5、再经100转/分离心10分钟。弃去上清液，加25毫升HAT培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个24孔培养板中，每孔0.5毫升；
6、将培养板放在水蒸汽饱和CO2孵箱中，37℃孵育。CO2含量为5%；
7、每2—3天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。2周后使用HT培养基。
六、注意事项：
1、细胞杂交瘤的实验全过程必须是在严格的无菌条件下进行，任何一个环节的疏忽均可导致严重污染。因而须严格的无菌操作。
2、试剂价格相对昂贵，应注意节省。
3、试验中的各个环节，尤其是结细胞融合过程和细胞克隆的筛选工作更为重视。
实验五 细胞克隆化培养技术—有限稀释法
一、实验目的：
1、掌握用有限稀释法进行细胞克隆化培养技术；
2、学会细胞克隆形成的辩观察技能；
3、配合抗体分泌细胞筛选技术，确定抗体分泌细胞。
二、实验原理：
克隆化培养即单细胞培养技术，用有限稀释法进行杂交瘤细胞克隆化培养，可以及时确定阳性杂交瘤细胞株，同时淘汰因发生染色体丢失或抗体的轻、重链基因分离而出现无抗体分泌阴性细胞株。
一般杂交瘤细胞需经过52—3次反复克隆后，才能达到100%细胞阳性率。 该办法亦适用于一般细胞培养中的细胞纯化、突变细胞株的选择，识别和分离。是细胞株的常用方法。
三、实验材料：
杂交瘤细胞、25毫升培养瓶、96孔细胞培养板（天津有机玻璃厂）、移液管（1毫升、5毫升、10毫升）、弯头滴管、倒置显微镜、CO2培养箱、白细胞计数板、计数器、盖玻片、防水笔、RPMI-1640、小牛血清、青链霉素、10毫升刻度离心管，00橡胶塞，饲养细胞（3-6×105/ml、见腹腔细胞的制备）。
四、实验步骤：
1、分装了每孔0.1毫升腹腔细胞的96孔细胞培养板（可提前24小时准备就绪，置CO2培养箱中备用）；
2、自细胞培养瓶中收集长势良好的杂交瘤细胞（亦可自24孔培养板孔中收集），制成悬液。
3、按白细胞计数方法准确计得细胞悬液的细胞数，一般在105/毫升左右。
4、取3支10毫升刻度离心管排列在超净工作台试管架上，先用无血清培养基将细胞稀释至103/毫升，再用含15%小牛血清的完全培养基稀释到101/毫升细胞，即每0.1毫升1个细胞。
5、每孔0.1毫升细胞悬液。
6、置37℃5%CO2培养箱，4天后取出观察，并在板盖上打上标记，做好记录并统计结果。
7、继续培养时，则在第4-5天更换1/2培养基，约第7-9天可以收获培养液上清用于检测抗体。并重复检测1-2次。
8、选择单克隆生长孔，生长良好，阳性强者，转移到24孔板再做克隆经培养或扩大培养。
五、实验结果：
实验结果以总细胞孔（如96孔）中出现克隆孔统计出克隆百分率，并可进一步按单细胞孔、双细胞孔、多细胞孔分别计算出百分率。
六、注意事项：
1、注意无菌操作，一旦发现污染（孔）必须及时处理；
2、计数细胞要求准确，稀释量亦要准确，否则将造成一孔多细胞克隆或克隆百分离太低；
3、在计数克隆出现率之前，不宜更换培养液，也不宜强烈振动培养板；
4、做克隆化培养的小牛血清必须是优质血清；
5、若做克隆抗体检测时，特别要保护细胞的生长状况，防止细胞生长不良甚至丢失。
七、说明：
哺乳动物细胞通过分离、稀释接种，培养在适宜于单细胞生长的培养液中，形成细胞克隆。运用这项技术可以制作细胞成活曲线，即在接种相同数量细胞的培养瓶中，加入不同浓度的化学药品，或照以不同剂量的射线，观察其对细胞的听见害程度。由此可以在哺乳类细胞中进行诱变试验及分离突变细胞。
实验六 杂交瘤细胞的冷冻保存和复苏技术
一、目的：
掌握冻存和复苏细胞的技术
杂交瘤细胞株一经建立应尽快冻存，以保证杂交瘤细胞不至于因传代污染或因变异而丢失，在克隆化前将抗体阳性的样本冻存，在一旦克隆传代失败或在增殖过程中丢失，还可将保存的杂交瘤细胞重新复苏，继续进行实验。将细胞冻存还可避免繁重的细胞传代工作量以及不明原因的污染和细胞在培养过程中的变异。
用于细胞融合的骨髓细胞株也可同样方法保存：以取得稳定可靠的亲本细胞来源。因此，冷冻保存细胞株是杂交瘤研究的一项重要的实验技术。
该技术同样适用于一般动物细胞的冷冻和保存。
二、原理：
主要是城保护下，降低保存温度甚至用深低温（—196）保存，借以减低或几乎停止细胞的活力的能量产生机构，从而延长保存期。
冷冻保护剂有许多种类，而较普遍采用的是二甲基亚矾（Demathy,Sulfoxide,DMSO）它的作用既能降低细胞的新陈代谢，又能维护细胞膜的强度，使水分不易进入细胞而影响其冷冻保存。
三、试剂、器材：
1640完全培养基，10%DMSO-1640完全培养基，无血清1640培养基。 恒温水浴、液氮罐、玻璃安瓶或带密封盖的塑料小管，装安瓶的小布袋，刻度离心管，胶塞、培养或小培养瓶、小烧杯、细胞计数用器材。
四、操作方法：
1、细胞悬液配制：取生长旺盛、形态良好的待冻存细胞，用离心法收集细胞，并用冻存培养基将细胞调至3-5×106/ml。
2、分装：将细胞悬液注入2ml安瓶中或塑冷冻管中，每支0.5—1.0ml，封紧（安瓶用火焰封口），每只安瓶上标上细胞名称、冻存日期、装入小布袋中。
3、缓慢降温，原则上要使冻存细胞瓶的温度每分钟下降1℃，待降至-60℃-70℃时，再将细胞浸没有液氮中，各实验室的操作方法根据细胞的种类和经验略有不同，以下两法均可使用。
①将细胞管先放置4℃或普通冰箱冰格内2小时，再移至液氮容器面上，停留30分钟后（约-60℃-70℃），再浸入液氮中。
②将细胞瓶放入壁厚1—2cm的聚乙烯泡沫塑料盒中（自制），密封后，放在—80℃冰箱中过夜，次日将细胞瓶移至液氮中。
亦有人将安瓶放在4℃冰箱中4小时，再置安瓶于气态氮中20分钟，然后立即放入液态氮中。
五、细胞复苏：
1、从液氮罐中取出安瓶或其它类型塑料冷冻管，有时冷冻管因未封严，浸入液氮后，取出后安瓶或管子内液迅速气化可以爆炸（力量有限）因此应戴手套和防护眼镜。
2、迅速放入装有37℃-40℃的热水烧杯中（放在超净工作台内），用镊子夹紧并不时摇动，令尽快融化。
3、如用安瓶冷存，取出后，用70℃酒精擦试消毒后。折断颈部，如用塑料管，则防止融融时渗入水，打开盖子，用吸管吸出悬液，注入离心管中，再补加10毫升培养液（滴加）；或直接滴入装有10ml培养液中（可以用无血清培养液）。
4、低速离心（1000转/分）5-7分钟，去上清，一般不再重复用培养液洗一次。
5、用培养液适当稀释后，装入培养瓶中或24孔培养板中37℃5%CO2培养箱内培养，次日更换一次培养液后，继续培养。
6、以后仍按常规传代培养进行培养。
注意事项：
1、安瓶或管内冻存的细胞数量要充分，在融解后能允许做1：10-1：20的稀释，最后细胞数量/毫升仍要比一般高一些，一般再培养接种浓度为5×104/毫升，因此冻存细胞密度应达到107毫升，在融后稀释20倍后，仍能保持5×105/毫升数量。
2、加入一定量的饲养细胞有助于复苏细胞成活，饲养细胞的密度一般105/毫升左右。
3、一般复苏细胞的成活率在20—70%左右。
参考资料：
①章谷生等主编：单克隆抗体医学上的应用 上海科学技术出版社 1987.4
②柏乃庆编著 人体保存（细胞、组织和器官的保存技术） 上海科学技术出版社 1985.3
③君等编译 单在隆抗体及细胞免疫实验技术 云南科学技术出版社 1986.12
④刘祖洞等编 遗传学实验（第二版）高教出版社 1987.11
实验七 流式细胞仪标本的制备
流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的
结果。
(一) 原理
活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
(二) 操作步骤
制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、
胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
↓
用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为
5×10６～１×10７／ml
↓
取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)
的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS
稀释)灭活正常兔血清
↓4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右
1000rpm×5min
↓
弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠
(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇
↓ 4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右
1000rpm×5min
↓
加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入
1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，
视细胞浓度加入100～500μl固定液)
↓
FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
(标本在试管中可保存5～7天)
(三) 试剂和器材
1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
(四) 注意事项
1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
附:
1. DPBS (×10, 贮存液)
NaCl 80g
KCl 2g 蒸馏水加至1000ml
Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
KH２PO４ 2g
2. 洗涤液
DPBS 900ml
FCS 50ml (终浓度 5％)
4％NaN３ 50ml (终浓度0.2％)
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖 20g (终浓度2％)
甲 醛 10ml
NaN３ 0.2g (终浓度0.02％)