动物细胞培养技术
实验报告
生物技术1004班 第四组
实验一仪器的清洗与灭菌及培养基的配制
一、实验目的
能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理
清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。常用的消毒灭菌方法有： (1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。
(2)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。 (3)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。以0．22 μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。(4)化学消毒法 70％(或75％)酒精：超净台里常备70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。
三、实验材料、用品
1．材料： PH试纸、三蒸水、量筒 烧杯（1000ml 2个250ml 4个100ml2个10ml 3个）、玻璃棒（3个）、250ml盐水瓶（8个）10ml盐水瓶(10个) 250ml玻璃螺口培养瓶（27支） 1.5ml离心管一瓶 微量可调移液器3个（1000ul配套枪头2盒） 注射滤器（0.22微米微孔滤膜）（4只） 带旋盖离心管10ml （3个）、离心管架一个 1把小镊子，3把剪刀，3把弯镊 3个100目钢丝筛网 牛皮纸 橡胶皮筋 标签纸 记号笔若干
2．药品：75％酒精，DMEM培养基试剂干粉一包、胰蛋白酶250mg，青霉素、链霉素（双抗液0.3g) KH2PO4 ，NaCl，NaHCO3 ，KCl ，葡萄糖Na2HPO4.H2O
3．仪器：超净台，高压蒸气灭菌锅，磁力搅拌器、电子天平。
四、实验步骤
(一)仪器的清洗与灭菌
玻璃器皿（16支250ml玻璃螺口培养瓶、3个培养皿、10ml小烧杯3个 ）
1．玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡30分钟
2．用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次，倒置自然干燥。
3．包装(牛皮纸或一般纸)，要标明班级及小组，防止混用丢失。
4．高压蒸汽灭菌。
5．贮存备用。
金属器械（1把小镊子，3把剪刀，3把弯镊 3个100目钢丝筛网 ）
1．先用清水清洗之后再用洗洁精清洗。
2．用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次，倒置自然干燥。
3．包装(牛皮纸或一般纸)，要标明班级及小组，防止混用丢失。
4．高压蒸汽灭菌。
5．贮存备用。
塑料制品（1.5ml离心管一瓶 1000ul配套枪头2盒 ）
1．用洗涤剂清洗塑料制品，自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次，倒置自然干燥。
2．包装(牛皮纸或一般纸)，要标明班级及小组，防止混用丢失。
3．高压蒸汽灭菌。
（二）试剂及培养基的配制
1. 水： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.
2. Hanks液的配制（《动物细胞培养技术》28页：
（1）甲液
KCl 0.04g 1甲液搅拌溶解，乙液单独溶解。
Na2HPO4.H2O 0.06g 2将乙液徐徐加入甲液中。
KH2PO4 0.06g 3将0.35g NaHCO3 单独溶解到37℃ 100ml三蒸水中
MgSO4`H2O 0.20g 4用数滴NaHCO3液溶解0.02g酚红
葡萄糖 1.00g 5将(3) (4)液移入甲乙混合液中
NaCl 8.00g 6用三蒸水定容至1000ml，充分混匀调pH到7.4，膜 三蒸水 100ml 封口4℃冰箱过夜。
（2）乙液 7次日滤过 ，分装4℃冷藏。
CaCl2 0.14g
三蒸水 100ml
3. 胰蛋白酶溶液：
称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂0.25g溶入小烧杯中的100ml双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。使用前用无菌NaHCO3调pH到7.2.然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
4．DMEM培养基（加入青、链霉素双抗）：
将青、链霉素双抗各0.3克和DMEM试剂粉一袋倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的DMEM溶液。无菌NaHCO3调PH到7.0—7.2。用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-4℃保存以备使用。
4.pH调整液
0.74g NaHCO3 单独溶解到37℃ 100ml三蒸水中，过滤膜除菌，分装4℃保存以备使用。
五、注意事项
1．清洗玻璃制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。
2． 高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。
3．牛血清、大部分培养基、胰酶、Hanks溶液和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压灭菌和紫外灭菌，可用过滤灭菌。
5．滤过除菌时，过滤时压力不宜过大。压力太大时微孔滤膜可能破裂。
6．超净工作台紫外灯开启时严禁进行其他操作，以防紫外对皮肤的伤害。
实验二小鼠肾脏、脾脏细胞原代培养
一、实验目的
能独立地进行细胞的原代培养，掌握细胞培养技术。
二、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。
Hanks液主要用于组织或细胞的漂洗。胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
三、实验材料、用品（每组）
1、材料：9支250ml玻璃螺口培养瓶、3个培养皿、10ml小烧杯3个，1.5ml离心管24个 1000ul配套枪头一盒 带旋盖离心管10ml 3个，废液缸， 8周小鼠，75％酒精棉球 微量可调移液器1000ul3个1把小镊子，3把剪刀，3把弯镊 3个100目钢丝筛网 酒精灯 3个
2、药品：DMEM培养基（含小牛血清和青霉素和链霉素双抗液)，胰蛋白酶，Hanks液，75％酒精。
3、仪器：CO2培养箱，超净台，恒温水浴锅，离心机。
其他：火柴 记号笔
四、实验步骤
（一）细胞培养
胰蛋白酶消化法（以脾细胞胰蛋白酶处理为例）
1、将小白鼠引颈处死后于含有75%酒精的大烧杯中浸洗3~5S。
2、用剪刀剪开小鼠腹部,迅速取出肝脏并用Hanks 液中进行漂洗3次，之后放入培养皿去除脂肪剪下肝组织小块。将小块用镊子移到小烧杯中用眼科剪子将鼠脾组织剪成的小块加入Hanks 液漂洗除去血细胞后移入1.5ml的离心管中剪成1mm左右的小快。
3、加入800ul胰蛋白酶消化液后，封口。置于于37 ℃恒温水箱中消化15~20min。
4、不断检查肝组织是否消化完全，可适当晃动帮助打散细胞直到组织变白疏松为止。
5、用移液枪吹打混匀，制成细胞悬液
6、用差速离心法400转/分钟离心2分钟去除大块未消化组织。
7、吸取上清700转/分钟离心7分钟
8、离心完后, 弃上清，再加入1ml DMEM完全培养基重悬单细胞，收集肝细胞于培养瓶中，加大约15 ml DMEM培养基，倾斜30°瓶内液体高度约为3mm，做好标记于37℃、5%CO2条件下培养一周。
（二）细胞培养(以脾脏细胞机械挤压过塞法处理为例)
1、将小白鼠引颈处死后于含有75%酒精的大烧杯中浸洗3~5S。
2、用剪刀剪开小鼠腹部,迅速取出肝脏并将其放入装有Hanks 液中进行漂洗3次。
3、用镊子夹取肝脏在套有200目不锈钢网的小烧杯上研磨，并不断用移液枪吸取适量Hanks缓冲液冲洗，过滤到小烧杯中，之后将过滤后的悬液装到一个1.5ml离心管中。
6、用移液枪补到相同体积，做好标记以700转/ 分离心7min, 弃上清。
7、再加入1ml的DMEM完全培养基重悬沉淀细胞，收集肝细胞于培养瓶中，加大约15 ml DMEM培养基，使瓶内液体高度为3mm，做好标记于37℃、5%CO2条件下培养一周
五 注意事项
1 用胰蛋白酶消化细胞时不能消化过度，否则会导致细胞死亡，活力下降
2使用机械研磨法时动作要轻柔，过度用力会使非细胞物质过网
3整个过程严格控制无菌操作，加试剂后试剂瓶过火焰再盖上
实验三细胞观察及活力测定
一、实验目的
1.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；
2.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；
二、实验原理
A细胞活力检测
倒置显微镜是组织培养实验中最重要的工具之一，将培养物放在显微镜的载物台上，打开电源，选择合适的镜头，聚焦于标本上，可以观察体外培养的细胞。
体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长。如羊水细胞为贴附型细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。
培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等，表明细胞代谢不良。
活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。
B活细胞计数
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。
血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(如图3)。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图4)每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。
图1 血球计数板的构造（a、平面图；b、侧面图）图2 血球计数板网格的分区和分格
三、实验材料、用品
1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、吸管、倒置显微镜、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔。
2、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇
3、材料：细胞悬液
四、实验步骤
倒置显微镜的使用
1．确保显微镜清洁（用70 ％乙醇擦拭载物台，如果有必要，用擦镜纸清洁物镜）。
2．打开电源，将灯光强度从最低开始，调至合适的强度，而不是直接打到强光。
3．检查光源与聚光器的连接
4．将相差环调至中央
5．检查细胞 室温时将培养瓶置于倒置显微镜下观察
检查培养基的清亮程度（例如，无碎片、漂浮的颗粒、污染迹象等），根据需要选择一个放大倍数更高的物镜
( a ）记录生长状态（例如，稀少、亚汇合、汇合、细胞排列紧密）。
( b ）记录细胞状态（例如，清亮、透明或有颗粒、有空泡等）。
6．记录观察的结果
7．旋低变阻器，关掉电源。
8．将培养液放回孵箱或放在超净台上。
活细胞计数（用普通显微镜）
（一）细胞悬液制备：
将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml，静置3-5min，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。
2染色制片：
取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合，2min后制成临时装片，镜检。
3染色结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色
（二）血球计数板计数
1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。
3、静置3分钟。
4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
五、注意事项
(1)观察体外培养细胞的几个问题；
细胞培养24h后，即可进行观察，观察的重点如下：
A.首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度
B.观察培养基颜色变化及细胞是否生长。
C.如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时可参照(2)的描述进行。
D．观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。
(2)细胞的生长阶段及其形态特征
A．游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆形，折光率高，此期可延续数h。
B．吸附期(贴壁)：由于细胞的附壁持性，细胞悬液静置培养一段时间(约7—8h)后，便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。
C.繁殖期：培养l2h以后直到72h，细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到细胞铺满整个瓶壁(即所谓形成细胞单层)的过程。此期细胞形态为多角形(呈现上皮样细胞的特征)。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。
D．维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。
E．衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙，细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。
细胞原代培养结果：
技4四组肾机械1 技4四组肾机械2
技4四组肾酶解1 技4四组脾机械2
实验四传代细胞培养
一实验原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二材料和试剂
1. 细胞：培养两周的贴壁细胞株
2. 试剂：胰酶、EMDM（含小牛血清和青霉素链霉素双抗）、Hanks液 75%酒精
3. 仪器和器材：培养箱、250ml玻璃螺口培养瓶18支、移液枪、枪头、废液缸等
三操作步骤
1. 吸除培养瓶内旧培养液。
2. 向瓶内加入适量消化液，以能覆满瓶底为限，轻轻晃动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。
3. 置温箱中2~5分钟，放置显微镜下观察，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。
4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液终止消化。
5. 用移液枪吸取DMEM培养基轻轻反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，吹打时动作要轻柔，不要过猛，同时尽可能不要出现泡沫，这些对细胞都有损伤，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。
6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。
四 传代培养的细胞观察
方法步骤同实验三原代细胞观察
注意事项
1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。
2. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
3. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
5. 瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。
6. 吸溶液的吸管等不能混用。
细胞传代培养结果：
技4四组肾机械1传代
技4四组脾机械2传代