《临床医学工程实践》报告

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(一) 实验目的、

1) 学习细胞传代知识 年09月08日 2011

2) 掌握细胞传代

3) 进行细胞传代

(二) 方法与材料、

1. 所用细胞：卵巢癌细胞HO-8910 HO-8910PM 2. 试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清） 3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

(三) 步骤、

1. 吸除培养瓶内旧培养液。

2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。

3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。

4. 吸除消化液，向瓶内注入培养液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加培养液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已 松动的细胞冲掉流失。

5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

6. 把细胞悬液吸取部分装入新培养瓶中，置温箱中培养。

细胞培养的一般过程

准备工作

准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试等; 取材;

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。 培养%

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细胞培养实验写报告内容

 1目的

2 原理

3材料与方法（操作步骤）

4实验结果

5结论或结果分析

 实验一  鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养

        实验二  滤泡性口炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）

实验三  Hep-2细胞的传代培养

实验四  VSV TCID₅₀滴定

实验五  干扰素活性（效价）的测定

    实验六  VSV中和试验（稀释血清固定病毒法）

实验二  鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养

一、目的

1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；

2、掌握活细胞的显微镜下观察；

3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断方法。

二、原理

离体动物组织通过温和的手段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和气相环境，并给予充足合适的营养条件，能生存、生长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，比如肌肉细胞的收缩功能；上皮细胞的分泌功能等。通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的这一段时期称为原(初)代培养。原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等的研究。                                                                                                                                            

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动物细胞培养技术

实验报告

生物技术1004班 第四组

实验一仪器的清洗与灭菌及培养基的配制

一、实验目的

能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。

二、实验原理

清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。常用的消毒灭菌方法有： (1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。

(2)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。 (3)滤过除菌   用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。以0．22 μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。(4)化学消毒法   70％(或75％)酒精：超净台里常备70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。

三、实验材料、用品

1．材料：   PH试纸、三蒸水、量筒 烧杯（1000ml 2个250ml 4个100ml2个10ml 3个）、玻璃棒（3个）、250ml盐水瓶（8个）10ml盐水瓶(10个)  250ml玻璃螺口培养瓶（27支） 1.5ml离心管一瓶 微量可调移液器3个（1000ul配套枪头2盒） 注射滤器（0.22微米微孔滤膜）（4只） 带旋盖离心管10ml （3个）、离心管架一个 1把小镊子，3把剪刀，3把弯镊 3个100目钢丝筛网 牛皮纸 橡胶皮筋 标签纸 记号笔若干

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动物细胞培养

一、试验目的。

1、掌握无菌操作技术。

2、掌握原代和传代细胞培养。

3、掌握细胞冷冻和复苏技术。

4、了解培养成纤维细胞的形态。

二、试验原理。

将动物机体的组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

对具有移动特性的稳定细胞系或细胞株进行长期保存，一方面可以作为细胞研究的试验材料，另一方面可以做细胞制品的生产材料。目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法，。细胞的冷冻保存的原则是慢冻快融，这样做是为了防止细胞由于冷冻过程中产生了冰晶而发生细胞破裂。

三、实验器材及药品。

器材：怀孕的小白鼠、培养箱、培养瓶、培养皿、移液器、眼科剪、镊子、酒精灯、离心机、水浴锅、倒置显微镜、CO₂培养箱、超净工作台、离心管、高压灭菌锅、试管架等。

药品：小牛血清、DMEM合成培养基、抗生素、DMSO冷冻剂、胰酶、PBS缓冲液等。

四、实验操作。

1、消毒灭菌。

将实验所需用到的工具（如枪头、培养皿、眼科剪、镊子以及每个人的实验服等）集中灭菌、烘干。配制75%的酒精以备实验时所需。

2、培养基的配制。

分别取10ml的小牛血清、90ml的DMEM合成培养基，将两种培养基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混匀就得到了细胞培养的培养液。

3、原代培养。

（1）、准备。将实验过程中会用到的工具以及药品全部放在超净工作台上进行紫外消毒灭菌。实验开始前带好乳胶手套，用酒精对手进行消毒。将怀孕的小白鼠放在酒精中杀死，取出子宫内的胚胎组织。

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L1120细胞培养

一．实验目的

1．了解培养室的设置和设备。

2．学习无菌概念和无菌操作要领，熟练各实验器材的使用。

3．学习并掌握L1120细胞培养使用的器皿、器械的洗涤，消毒和灭菌。

4．熟练掌握培养基（RPMI1640）的配制，了解其它培养基的配制方法。

5．掌握L1120细胞传代培养的方法。

6．掌握细胞冷冻,复苏的方法.

7. 掌握体外培养L1120细胞的常规检查内容及方法。

二．实验原理

L1120细胞是一种肿瘤细胞。肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。

组织培养肿瘤细胞生物学特性

（－）形态和性状

培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。

 （二）生长增殖

肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。

 （三）永生性

    永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。

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实验篇

实验一 实验器材的清洗

实验物品

（一）每一大组公用物品（每班分6大组）

吸球4个、酒精棉球瓶两个、消毒水一瓶、吸瓶两个、计数板1块、洗液缸一个、95%酒精1瓶。

（二）每一小组公用物品（两人一小组）

刻度吸管5毫升4支, 小漏斗1个、 80-200铜滤网1块、培养皿2个、 l00毫升盐水瓶 及塞子4个、l0毫升盐水瓶 及塞子1个、100ml培养瓶及塞子4个、10ml培养瓶及塞子1个、镊子1个、剪刀1把、冻存管（1.5毫升，2毫升）2个、软毛刷2个、塑料盆一个。

（二）公用物品

小滤器、大滤器2个、1000毫升量筒2个、100毫升量筒2个、家用剪刀、耐酸乳胶手套长的两双、短的四双 、酒精一壶、玻璃棒几个、 0.22μm的小滤膜一盒、电炉3个。

清洗注意事项和要求

（一）使用后的实验器材应立即投入清水中。带毒的玻璃器皿需先浸泡在5％来苏儿或1％盐酸溶液中（依病毒的种类而定）1天以上或高压灭菌。

（二）浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。

（三）煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂（直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右）；若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化PH值上升。

（四）软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。玻璃划痕处易残留洗涤剂,会改变培养液PH和毒害细胞。

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（五）浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水1盆”、”蒸馏水2盆。

（六）器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，这样省时又保证清洗质量。

（七）清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落人灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。

（八）刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗；不得残留洗涤剂、清洁液。

操作方法

（一）清洗液（俗称酸液）的配制方法

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一、实验目的

1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。

2、学习并掌握细胞传代培养的方法。

3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。

二、实验原理

细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。

动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。

传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。

    高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

三、细胞培养相关设施及材料

1、细胞培养室

无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。

孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO₂。

制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。

储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。

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