实验二 细胞的传代培养

【实验目的】

了解贴壁细胞传代和换液的意义。

掌握贴壁细胞换液和传代基本方法。

【实验原理】

细胞在培养瓶里的生长，分为贴壁生长和悬浮生长。一般，除血液以外的组织，细胞培养都是贴壁生长的。贴壁生长细胞在培养瓶中生长几天后，就会在培养瓶底部长满，如果不进行处理，就会继续生长而产生堆积，最后因缺乏营养供给而死亡。所以，当细胞生长贴满瓶底时，就需要将细胞稀释，并分成多瓶细胞（也就是接种成多瓶细胞），使细胞继续生长。 那么这一处理接种的过程就叫传代。接种一次就叫做传一代，继续生长几天再接种，就叫传2代。通过传代，扩增了细胞的数量。细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供实验所需，传代培养也是组织培养常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。 接种后的细胞放在培养箱里生长，培养的温度视动物的体温而定。一般，温水性鱼类细胞培养的最适温度是25℃，热带鱼类30℃，冷水鱼类 20℃，哺乳动物 37℃ 。

细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏，代谢产物增多，变酸等不适宜细胞生长因素，但细胞还未生长达到饱和密度（没有贴满底部），又仍需继续培养，此时更新营养液方式来更新营养成分，以满足细胞继续生长繁殖的需要，这一过程叫换液。单纯换液不需要接种细胞。

【器材、材料与试剂】

（一） 仪器

生化培养箱或CO2培养箱，倒置显微镜，超净台

（二）材料

2mL，5mL移液管（每组各3根），培养瓶（每组1个），离心管（每组1个），75%的棉球， 酒精灯，废弃缸，橡皮头，软管，加液枪，记号笔，细胞系。

（三） 试剂

培养基（1640或 MEM ，添加10% 小牛血清或胎牛血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA（PBS-EDTA）

【组织安排】

上午8:30开始集体看视频，“细胞传代培养方法”； 每人在超净台外练习相关操作；10:30 开始分批上超净台实验。以24人为例，实验分4批来上超净台，上午、中午做2批，下午做2批，每批来6人（3个超净台），2人一组用一个台。

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细胞培养实验写报告内容

 1目的

2 原理

3材料与方法（操作步骤）

4实验结果

5结论或结果分析

 实验一  鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养

        实验二  滤泡性口炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）

实验三  Hep-2细胞的传代培养

实验四  VSV TCID₅₀滴定

实验五  干扰素活性（效价）的测定

    实验六  VSV中和试验（稀释血清固定病毒法）

实验二  鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养

一、目的

1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；

2、掌握活细胞的显微镜下观察；

3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断方法。

二、原理

离体动物组织通过温和的手段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和气相环境，并给予充足合适的营养条件，能生存、生长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，比如肌肉细胞的收缩功能；上皮细胞的分泌功能等。通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的这一段时期称为原(初)代培养。原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等的研究。                                                                                                                                            

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　实验：细胞培养

　　1.实验目的

　　初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。

　　2.实验原理

　　从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。

　　细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

　　细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。

　　3.实验用品

　　3.1 材料和标本 乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)

　　3.2 器材和仪器 手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。

　　2.3 试剂 含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。

　　4.实验方法

　　4.1 原代细胞培养

　　4.1.1 原理

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实验四 动物细胞的传代培养

1. 实验目的

（1）了解动物细胞培养的基本知识。

（2）了解体外培养细胞的的基本形态类型；学会通过镜检判定体外细胞生长的状态。

（3）掌握动物细胞的传代培养法。

2.实验背景与原理

2.1 动物细胞培养的基本概念

（1）组织培养：把来自机体内的细胞、组织或器官放在类似于体内的外环境中，使之成活、生长和繁殖。严格又分为细胞培养、组织培养和器官培养。值得注意的是和植物组织培养不同，目前动物组织培养在一般培养条件下难以维持组织的结构和功能，常最终转变成为细胞培养，所以动物细胞与组织培养并无严格区别。

（2）原代培养：直接从供体取来的细胞，组织或器官进行的初次培养。通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。

（3）传代培养：原代培养物长成单层细胞，达到一定密度时，营养消耗殆尽，需要补充营养，分开扩大培养，使之继续增殖。注意的是传代的这个“代”与细胞分裂的一个世代不同，一代细胞约分裂3~5次，不要混淆。

（4）细胞系：原代培养后的细胞经传代即可成为细胞系。若其形态均一，生长增殖稳定，生物性状明确，即可称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。不同种类的细胞成系的难易程度也不同，一般胚胎、更新组织的细胞如造血、上皮等以及癌细胞较容易成系，而神经等细胞则较难成系。按照其生存期可分为有限细胞系（生存期有限的正常二倍体细胞）和无限细胞系（生存期无限的癌细胞、转化细胞等，大多异倍体）

2.2 动物细胞培养的基本条件

体外培养细胞的条件总原则就是要尽可能模拟细胞在体内生长的环境，因此必要的营养、适宜的胞外环境以及严格的无菌条件是主要的三个方面。

（1）营养：早期培养主要采用天然的生物性液体，但其成分不确定，难以控制营养成分。现广泛使用的是化学成分明确的各种商品化的合成培养基，其主要成分包括各种氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等必要的营养物质。培养基中还含有酚红指示剂，使培养基的颜色可显示细胞生长状态。随着细胞数目的增长，酸性代谢物增多，培养基变黄。污染的培养物也会使培养基迅速变黄。

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实验5 细胞的传代培养

一、实验目的

熟练掌握动物细胞的传代培养法。

二、实验原理

哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。

三、仪器、材料与试剂

1仪器

CO2培养箱，倒置显微镜，超净台

2材料

培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。

3试剂

完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。

四、实验步骤

1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。

2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。

3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。

4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。

5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。

6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。

8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。

9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。

10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

五、注意事项

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动物细胞培养

一、试验目的。

1、掌握无菌操作技术。

2、掌握原代和传代细胞培养。

3、掌握细胞冷冻和复苏技术。

4、了解培养成纤维细胞的形态。

二、试验原理。

将动物机体的组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

对具有移动特性的稳定细胞系或细胞株进行长期保存，一方面可以作为细胞研究的试验材料，另一方面可以做细胞制品的生产材料。目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法，。细胞的冷冻保存的原则是慢冻快融，这样做是为了防止细胞由于冷冻过程中产生了冰晶而发生细胞破裂。

三、实验器材及药品。

器材：怀孕的小白鼠、培养箱、培养瓶、培养皿、移液器、眼科剪、镊子、酒精灯、离心机、水浴锅、倒置显微镜、CO₂培养箱、超净工作台、离心管、高压灭菌锅、试管架等。

药品：小牛血清、DMEM合成培养基、抗生素、DMSO冷冻剂、胰酶、PBS缓冲液等。

四、实验操作。

1、消毒灭菌。

将实验所需用到的工具（如枪头、培养皿、眼科剪、镊子以及每个人的实验服等）集中灭菌、烘干。配制75%的酒精以备实验时所需。

2、培养基的配制。

分别取10ml的小牛血清、90ml的DMEM合成培养基，将两种培养基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混匀就得到了细胞培养的培养液。

3、原代培养。

（1）、准备。将实验过程中会用到的工具以及药品全部放在超净工作台上进行紫外消毒灭菌。实验开始前带好乳胶手套，用酒精对手进行消毒。将怀孕的小白鼠放在酒精中杀死，取出子宫内的胚胎组织。

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一、实验目的

1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。

2、学习并掌握细胞传代培养的方法。

3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。

二、实验原理

细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。

动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。

传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。

    高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

三、细胞培养相关设施及材料

1、细胞培养室

无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。

孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO₂。

制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。

储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。

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