实验5 细胞的传代培养

一、实验目的

熟练掌握动物细胞的传代培养法。

二、实验原理

哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。

三、仪器、材料与试剂

1仪器

CO2培养箱，倒置显微镜，超净台

2材料

培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。

3试剂

完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。

四、实验步骤

1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。

2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。

3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。

4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。

5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。

6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。

8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。

9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。

10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

五、注意事项

1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。

2.每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。

六、实验报告

1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤？

2.细胞传代培养的目的是什么？

第二篇：细胞工程实验-动物细胞传代培养

实验四 动物细胞传代培养

一、实验目的

1.掌握消化法细胞传代培养的原理。

2.了解细胞传代培养所需专用设备、试剂。

3.学习细胞传代培养操作。

二、实验原理

动物细胞原代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，会进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。这时需要进行分离培养，细胞由原培养瓶按1：2或1：3稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。80%汇合或刚汇合细胞是理想的传代阶段。

消化法细胞传代培养，是用一定含量的胰蛋白酶来进行消化，使贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。

三、主要仪器与试剂

1.实验仪器：改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、抽滤装置、超纯水器、倒置显微镜、二氧化碳培养箱

2.实验试剂及材料：PE液、0.25%胰蛋白酶液、MEM+10%小牛血清液、原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞

四、实验步骤

1.用75%酒精消毒双手、工作台面、培养瓶、瓶盖、试管，并过火焰。

2. 从布袋中取出已消毒的吸管，插入加样器，过火焰后吸取2mlPE，于侧壁加入， 轻摇后倒掉。

3.再加入5ml PE于侧壁，轻摇4-5min，于镜下观察，倒掉。

4.加入0.3ml 胰酶，扭紧瓶盖，观察，并轻拍。

5.大部分细胞脱壁后加入5mlMEM(含10%血清)，吹打形成细胞悬液。

6.将2ml细胞悬液移至玻璃培养瓶中，并取3ml MEM，加1ml MEM于玻璃培养瓶中， 另外2mlMEM加入到塑料培养瓶中，过火焰，扭紧瓶塞。

7.在瓶壁上做标记。

8. 将传代好的培养瓶放置于37度二氧化碳培养箱中培养。

五、实验结果

细胞由刚传代好时的圆球型（游离期）→贴附（贴壁期）→伸展（铺展）→细胞扁平或呈梭型→繁殖

六、思考题

1.请结合实验体会简述细胞传代培养成功的标志和显微镜下观察到的现象。（消化前后、游离期、贴壁期、指数生长期等不同时期细胞状态、培养液的清澈度、颜色、细胞界限等），并比较成功与不成功培养及其他培养状态的差别。

①传代培养成功的标志：

1

透明度大、细胞内颗粒少、没有空泡，胞膜清晰，胞液清晰透明，悬浮细胞碎片少，培养基澄清且颜色偏黄色，说明细胞生长状态良好且数量较多。

②显微镜下观察到的现象： 消化前：细胞长满培养瓶底，呈梭形，细胞紧密无间隙。 消化后：细胞质回缩，细胞间隙增大，细胞变圆，细胞从瓶壁脱落下来并悬浮和流动起来。 游离期：细胞间隙增大，细胞圆球形，细胞悬浮，培养液浑浊呈乳白色。 贴壁期：细胞扁平或梭型，透明度较好。 指数生长期：培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合，细胞密度增大。

③成功与不成功培养及其他培养状态的差别： 成功培养状态：透明度大、细胞内颗粒少、没有空泡，胞膜清晰，胞液清晰透明，悬浮细胞碎片少，培养基澄清且颜色偏黄色。 不成功培养状态：胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒， 细胞之间出现空隙，细胞形态不规则。若被污染，当细胞刚污染时，会发现细胞形态不饱满，细胞反差变大，细胞质颗粒变多，细胞延展性差。随着污染的加重，贴壁细胞脱落，培养基中杂质多，培养液很快变黄，且浑浊。

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