实验一：实验器材准备
【实验原理】
细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。三室既相互连接又相对独立，各自完成培养过程中的不同操作。
【实验目的】
①培养室的设置和设备。
②无菌概念和无菌操作要领。
【操作步骤】
1．实验室设置
（1）配液室
（2）准备室
（3）培养室
培养室内要完全密闭，保持恒定的温度，在设计上要注意以下几点：
①培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照射的地方，防止室内温度增高。
②天花板的高度不要超过2米，以保证紫外灯的有效杀菌效应，
③门一般用拉门，以防止空气流动。
④天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。
2．实验室常用设备
（1）准备室的设备
①双蒸馏水蒸馏器：制备双蒸水。
②酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。
③干燥箱：洗涤完的玻璃器皿用干燥箱烘干。
④高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。不同物品其有效灭菌压力和时间不同。
⑤储品柜1：放置未消毒物品。
⑥储品柜2：放置已消毒物品。
准备室注意事项：
①预防蒸馏器被烤干。
②勿将酸液溅到衣物或地面。
③勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。
④已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。
（2）配液室的设备
①天平（扭力天平和电子天平）：称量用
②pH计。
③磁力搅拌器。
（3）细胞培养室的设备
①超净工作台：
超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其工作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，徐徐通过台面，这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。
根据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，基本原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。但两种净化台的气流方向不同。
使用超净工作台应注意的几点问题：
A．净化工作台最好安装在无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命。
B．新安装的或长期未使用的工用台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。
C．每次使用工作台时，应先用75%酒精擦洗台面，并提前以30~50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。在关闭紫外灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。
D．净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰。
E．一般情况下，高效过滤器三年更换一次。更换高效滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。要定期将粗过滤器中的过布（无纺布）拆下清洗，时间应根据环境洁净程度而定，通常间隔3~6个月进行一次。
F．每次使用净化台要及时清除工作台面上的物品，并用洒精擦洗台面使之始终保持洁净。
②4℃冰箱和低温冰箱：
③CO2培养箱：
A．一定浓度的CO2对细胞生长，尤其是原代培养和单细胞培养有促进作用（5%）。
B．一定浓度的CO2可维持培养液恒定的pH。适用于开放培养，培养箱封口后，可在一般恒温培养箱内培养，但是采用培养皿或多孔板培养时，则需要高湿度和高CO2含量的空气。
C．它增加了湿度，箱体内装有水浴，可以保证培养箱内的湿度。
D．培养箱内装有紫外灯。
E．通过气体流量计可以调节CO2和空气的比例。
F．在水中可加入防腐剂（二氧乙酸）。可防止因CO2培养箱中湿度较高，易长霉菌。
④离心机：
⑤CO2钢瓶：
⑥液氮罐：
⑦储品柜：用来存放杂物
⑧紫外灯：
⑨空气净化系统
⑩倒置显微镜
3．无菌操作
（1）无菌室的灭菌：
①紫外灯无人时就要打开；
②进无菌室要穿无菌服、戴帽子和口罩；
③每周清洗消毒一次；
④所用物品要以外科手术方式严格消毒；
⑤室内台面要要保持洁净，做完实验后，用75％酒精或千分之三新洁尔灭棉球擦拭超净工作台的台内、边台的台面、倒置显微镜的载物台等；
⑥所用物品要一次性准备好；
⑦瓶口要用酒精火焰消毒；
⑧尽量减少出入。
（2）实验人员的无菌准备：
①肥皂洗手
②穿好隔离衣
③酒精棉球擦手
【思考题】
1． 观看演示填写出无菌操作的要领。
2． 在无菌室工作时应注意的事项是什么？
实验过程中如何才能在头脑中形成良好的无菌概念？
实验二：动物细胞前处理
【实验原理】
培养的动物细胞大都取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，将组织取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，在培养箱中培养，这个过程称为原代培养。细胞在培养瓶中贴壁生长。随着细胞的生长和增殖，培养瓶中的细胞越来越多，需要定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中培养，这称为传代培养。
实验三：动物细胞培养用液的配制
【实验原理】
熟练掌握培养基(RPMIl640和DMEM)的配制，了解其他培养基的配制方法。
【实验目的】
组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、贴附因子等，这是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清(10％。20％)。
【实验器材】
材料：3 000 mL锥形瓶，250 mL或500 mL培液瓶，翻帽塞，饭盒，pH试纸，孔径0．22 μm的微孔滤膜。
药品： 盐酸，无离子水，小牛血清，合成培养基(RPMI1640或DMEM)，青霉素，链霉素，NaHC03。
仪器(请参看仪器图库)： 滤泵(进口)1套，滤器(进口)1套，蒸馏器，高压灭菌锅，磁力搅拌器。
【操作步骤】
（相关链接培养基的制作方法）
(一)准备和安装过滤器 清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0．22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。 在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用滤泵做正压过滤，压力数字为2。 过滤后要检查滤膜是否完好无损。
(二)合成培养基的配制
1．去离子水用蒸馏器进行重新蒸馏(去除无机和有机杂质)，制3 000 mL三蒸水。三蒸水应及时使用，如果放置一段时间，则使用前须高压处理(15磅20 min)。
2．待水温降至15—30℃C，加入合成培养基干粉，用磁力搅拌一定时间(2—4 h)使之充分溶解。
3．配制RPMll640培养基时应通入适量C02或加入6 mol／L盐酸调pH至6．0左右，这样才能充分溶解。
4．加入一定量NaHCO，调节pH至7．0左右。
5．加水至最终体积。
6．在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。
7．瓶口封好，4℃冰箱贮存(RPMI1640培养基可以-20℃贮存)。
(三)小牛血清的处理 市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体(近来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。
1．将血清加热至56℃并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。
2．处理后的血清贮存于4℃。
3．小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量(见八、新生牛血清的筛选)。
(四)生长培养基的配制 除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清和抗菌素。
1．培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。
2．按如下比例配制： 基本培养基占80％－90％，小牛血清占10％－20％。 按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 μ／mL,。
【注意事项】：
1．培养细胞使用的瓶子和饭盒应与提取RNA和培养细菌的瓶子和饭盒严格分开。因为用于处理提取RNA的DEPC水(0．1％焦炭酸二乙酯)是一种致癌剂，并可能影响细胞生长；而培养过细菌的用品也不应与细胞混用。
2．过滤时压力不要太大，以压力数字2为宜，否则细菌易滤过达不到除菌效果，或使滤膜破裂。分装时需根据使用量的多少分装于大小合适的瓶子中(分装量为使用3．5次用完为宜，并且每瓶只能装2／3体积的液体，过多时瓶子易爆或胶塞自喷)。
3。滤器用毕立即刷洗，过蒸馏水，晾干收藏。
【操作步骤—详细—细胞培养用液的配制与消毒】
器材与试剂：
干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。
具体步骤：
一. 水的制备：
细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水
二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：
1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒：
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
四.青、链霉素溶液的配制于消毒
1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。
2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。
3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克？
五.RPMI1640的制备与消毒：
1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。
2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。
5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。
六．血清的灭火：
细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。
七.HEPES溶液：
HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：
准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。
注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。
八.谷氨酰胺：
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。
一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
九.肝素溶液的配制：
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为 ℃ 。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。
十.Ⅰ型胶原酶：
0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。
十一.明胶溶液：
因为明胶难于过滤，所以配制0.1％明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中，4℃保存。
其他培养用液的配制：
20ug/ml内皮生长因子，
注意事项：
1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米 和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。
3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。
实验四：细胞原代培养
―乳鼠组织块法原代培养
【实验原理】
直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养称为原代细胞培养。原代培养是建立各种细胞系的第一步，是从事培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。根据培养方法不同分为组织块培养法和单层细胞培养法（消化培养法）。
原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种细胞成分组成，比较复杂，因而原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需对细胞进行纯化。
【实验目的】
掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培养过程中的无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的观察方法。
【仪器、材料及试剂】
1．仪器：培养箱、培养瓶、培养皿、弯头吸管、移液管、手术器械
2．材料：新生1～3天的乳鼠
3．试剂：DMEM培养基，Hank’s液，酒精。
【操作步骤】
组织块直接培养法
①将新生大鼠引颈处死，置75%酒精泡2—3 S（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再在超净台内将新生小鼠解剖，取肝脏，置平皿中。
②用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
③用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次。
④将组织块用眼科镊送入培养瓶內，用弯头吸管将组织块在瓶壁上均匀摆置，每小块间距0.5 cm左右。25mL的培养瓶以20－30块为宜。组织块放好后，翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块，置37℃培养箱静置3—5 h，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
⑤组织块培养3～5 d后进行换液。
【注意事项】
1．自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。
2．在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
3．操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼后应该待其冷却才能夹取组织。
4．操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
5．待组织块略干燥能黏贴附于瓶壁时再使之与培养基接触，勿使组织块漂浮起来。如果组织块没有贴壁，则细胞不易生长，即使生长也因没有贴在瓶壁上面而无法收集到。
附胰酶消化法
①同组织块法前三步。
②视组织块量加入5—10倍的0.25%胰酶液，37℃水浴中消化20—40 min，每隔5 min振荡一次，使细胞分离。
③待组织变得疏松，颜色略为发白时，加入3—5ml培养液（含10%小牛血清）以终止胰蛋白酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
④1000rpm，离心10 min，弃上清液。消化后将细胞悬液通过100目孔径不锈钢网滤过，以除掉未充分消化的大组织。
⑤加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
⑥加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
⑦将细胞调整到5×105个/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。
【实验报告】
记录实验过程和细胞生长情况
【思考题】
1.细胞培养中如何防止污染？
2.组织块培养3～5 d后进行换液的目的是什么？
3.比较组织块培养法和消化培养法获得原代培养物的效果和各自的优缺点。
实验五：培养细胞的观察及保藏
【实验原理】
倒置显微镜观察细胞形态。
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于－196℃液氮中低温保存，以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候可以再复苏细胞用于实验，而且也起到了细胞保种的作用。除此之外还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。
在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
【实验目的】
掌握倒置显微镜观察细胞形态的方法。
细胞冻存的方法，熟练进行细胞冻存操作。
【仪器、材料及试剂】
1．仪器：倒置显微镜，4℃冰箱，-70（－80℃）冰箱，液氮罐，离心机等。
2．材料：冻存管、离心管、吸管等。
3．试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）等。
【操作步骤】
①消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。
②1000rpm离心5 min，弃上清液。
③沉淀加适量冻存液（10％甘油＋90％培养基或10％DMSO＋90％培养基），制成细胞悬液。细胞浓度宜大，3×106 个/mL左右。
④将悬液分至冻存管中，每管1～1.5 ml。将冻存管口封严。
⑤贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。按下列顺序降温：4℃（30min）→－20℃低温冰箱（1.5～2h）→－80度低温冰箱（4～12h）→液氮。
【注意事项】
1.操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
2.如使用含DMSO的冻存液，因为DMSO在室温状态易损伤细胞，所以在细胞加入冻存液后应尽快放入4℃环境中。
3.采用“慢冻快融”的方法能较好的保证细胞存活。
附：细胞复苏
①从液氮中取出冻存管、迅速置于40℃水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
②用75％酒精棉球清洁冻存管管口，打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
③1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
④沉淀加适量培养液，吹打均匀，将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。如冻存液使用的是甘油，复苏时可不用离心，直接加入适量培养液，吹打均匀，进行培养。