实验七 牛乳中酪蛋白的制备
目的要求：
学习从牛乳中分离纯化酪蛋白的原理和方法。
实验原理:
牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质。其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质。不溶于水、乙醇及有机溶剂，但溶于碱溶液。牛乳在pH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称乳清蛋白。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强、分散性高，在乳中呈高分子状态。
本法利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。酪蛋白含量约为35g/L。
试剂和器材
一、试剂
95%乙醇；无水乙醚；乙醇—乙醚混合液 (V/V=1∶1)；冰乙酸 。
0.2mol/L pH4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL：
A液：称取NaAc?3H2O 54.44g，定容至2000mL。
B液：称取优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000mL。
取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。
二、材料
牛奶制品。
三、器材
低速离心机，精密pH试纸或酸度计，水浴锅，烧杯，温度计，天平。
操作方法
1．将25mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7醋酸缓冲液25mL。用精密试纸或酸度计调pH值至4.7。
将上述悬浮液冷却至室温。离心15min(3000r/min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。
2．用等体积水洗沉淀三次，离心10min(3000r/min)，弃去上清液。
3．在沉淀中加入约10mL乙醇，搅拌片刻，离心10min(3000r/min)弃上清。
4．用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次；最后用乙醚洗沉淀2次，2mL/管。
5．将沉淀从离心管转移出来，摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。
6．准确称重，计算酪蛋白含量（g/100mL牛乳）, 并和理论含量为3.5g/100mL牛乳相比较，求出实际得率。
思考题
1．制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？
第二篇：实验二 酪蛋白的制备
【《应用生物制药技术》实验指导】
实验二 酪蛋白的制备
一、实验目的
熟悉学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
二、实验原理
牛乳中主要蛋白质是酪蛋白，含量35g/L，酪蛋白是一些含磷蛋白的混合物，pI值为
4.7。利用等电点时溶解度最低原理，将牛乳的pH调至4.7，酪蛋白沉淀下来，再用乙醇和乙醚洗涤沉淀除去脂类杂质可得纯的酪蛋白。
附：酪蛋白介绍 酪蛋白是哺乳动物包括母牛，羊和人奶中的主要蛋白质。牛奶的蛋白质，主要以酪蛋白(Casein)为主，人奶以白蛋白为主。酪蛋白是一种大型、坚硬、致密、极困难消化分解的凝乳(curds)。
酪蛋白是乳中含量最高的蛋白质，目前主要作为食品原料或微生物培养基使用，利用蛋白质酶促水解技术制得的酪蛋白磷酸肽具有防止矿物质流失、预防龋齿，防治骨质疏松与佝偻病，促进动物体外受精，调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效，尤其是其促进常量元素（Ca、Mg）与微量元素（Fe、Zn、Cu、Cr、Ni、Co、Mn、Se）高效吸收的功能特性使其具有“矿物质载体”的美誉，它可以和金属离子，特别是钙离子结合形成可溶性复合物，一方面有效避免了钙在小肠中性或微碱性环境中形成沉淀，另一方面还可在没有VD参与的条件下使钙被肠壁细胞吸收，所以CPPs是最有效的促钙吸收因子之一，它的发现为补钙制品的研发提供了一种新方法。目前，CPPs已被公认为国内外研究最多、最深入，应用领域极为广泛，且极具开发价值的一类分子结构与生物功能间有明确对应关系的活性多肽物质。
酪蛋白为非结晶、非吸潮性物质，常温下在水中可溶解0.8-1.2%，微溶于25℃水和有机溶剂，溶于稀碱和浓酸中，能吸收水分，当浸入水中则迅速膨胀，但分子不结合。
三、实验用品
1、材料
牛奶（40℃预热 ）。
2、试剂
（1）95%乙醇
（2）无水乙醚
（3）pH4.7 HAC-NaAC 缓冲液 （ 40℃预热 ）
（4）乙醇-乙醚混合液（V/V=1/1）
3、主要仪器设备
（1） 离心机， 天平，滤纸（Φ=9cm），表面皿
（2）抽滤装置（布氏漏斗，抽滤瓶，圆形抽滤管，橡皮塞）
（3）水浴锅
（4） 通风柜
四、实验步骤
（1） 各小组按以下步骤需要的量配制pH4.7 HAC-NaAC 缓冲液（83g无水NaAc溶于水加
约60mL冰HAc，稀释至1L，并注意调节pH至4.7）及乙醇-乙醚混合液（V/V=1/1）。
（2）将牛奶和pH4.7 HAC-NaAC 缓冲液预加热至40℃。
（3）用离心管取50mL的牛奶再缓缓加入50mL的pH4.7 HAC-NaAC 缓冲液，不时搅拌均匀，将悬浮液冷至室温，离心，3500r/min，15min，弃上清，得酪蛋白粗制品。
（4）用蒸馏水洗沉淀（不要搅散）3次，再次离心，3000r/min，10min，弃上清。
（5）在沉淀中加入约20mL 95%乙醇，搅拌片刻，将悬浊液全部转移到布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次，最后用无水乙醚洗沉淀2次，抽干。
（6）将沉淀摊开在表面皿上，风干（或烘干），得酪蛋白纯品。
（7）称量，计算含量和得率。
注：含量： 酪蛋白 g/100mL牛乳
得率： 测得含量/理论含量×100%
（理论含量为 3.5g/100mL牛乳）
五、注意事项
1、牛奶与缓冲液要预热。
2、缓冲液要缓加缓搅。
3、实验环境要保持空气流通，门窗要开。
六、作业
认真完成实验报告。