黄酮标准曲线绘制的实验报告
1.总黄酮的测定
1.1 实验仪器
电子天平AR2140;
紫外可见分光光度计UV2754;
型数控超声波清洗器KQ3200DB;
超级恒温槽;
Rotavapor R200 旋转蒸发仪 ;
FD21C250 冷冻干燥机2
1.2 试剂及药品
芦丁 标准品
硝酸铝 国产分析纯（配成5 %）
亚硝酸钠 国产分析纯（配成10 %）
氢氧化钠 国产分析纯配成（配成1mol/L）
95%乙醇，无水乙醇 国产分析纯（配成60%乙醇 50%乙醇）
DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）
Vc（Ascrobic acid，维生素 C，抗坏血酸）
没食子酸对照品：基准纯。
大青叶子 采摘于海南大学东坡湖畔
1.3实验步骤：
1.3.1准备工作及波长的确定
样品60℃烘干粉碎机粉碎，过20目筛，装入试剂瓶中备用。根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。
1.3.2参照品芦丁标准溶液的制备
精密称取120 ℃干燥至恒重的芦丁标准样品37.5mg置于100mL烧杯中,用60%乙醇溶解后定容至25mL 容量瓶中,摇匀，即可得1.5mg/mL的芦丁标准溶液。
1.3.3标准品的测量及绘制标准曲线
精密吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL ,分别置于10mL 容量瓶中，并定容至刻度线。得到0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml的标准品溶液，分别取1ml到试管中各加5 %亚硝酸钠溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加1mol /L氢氧化钠溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min 后,分别在510nm 处测定其吸光度（Tai,Cai&Dai,2011）。（以试剂空白做参比）
以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2。
表1-1： 芦丁标准曲线测定数据
图1-2：芦丁标准曲线
1.3.5样品的测试
根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。取黄酮提取液， 取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。取稀释好的溶液4份1ml置入10ml的比色管中，其中一份用60%的乙醇定容，作为参比溶液。其余各份各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加1mol 氢氧化钠溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以芦丁为参比）,三次结果取平均值。经换算后得样品中总黄酮含量。
样品总黄酮含量(mg/g)=X*n*V1/( V *W)
式中：X—测出的浓度，mg/ mL;（直接代入，不用换算。）
n—稀释倍数，量纲为1;
VI—样液总体积，mL;
V—测定时取样体积，mL;
W—样品质量，g。
2.总分含量的测定
2.1 实验仪器
ALZO4型电子分析天平:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;
DELA犯O型pH计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;
723可见分光光度计:上海菩华科技仪器有限公司;
DK一512型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;
容量瓶(250mL，10OmL，25mL)、比色管管(10mL);
烧杯、移液管、吸耳球。
2.2试剂及药品
没食子酸对照品：基准纯，购于上海分析试剂厂，置50℃真空干燥箱真
空中干燥4 h。乙醇为工业级，蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
2.3 Folin—Ciocalteu比色法测定总酚酸含量
3.3.1 Folin—Ciocalteu试剂的配制
称取20 g钨酸钠和5 g钼酸钠于圆底烧瓶中，用140 ml蒸馏水溶解，加入10ml 85％的磷酸溶液和20 ml浓盐酸，文火回流10 h，然后加入3 g硫酸锂及15 ml双
氧水，加热沸腾15 min至亮黄色，不得带微蓝和绿色。冷却，移入250 ml容量瓶中，定容，贮于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
2.3.2对照品溶液制备
准确称取15．00 mg干燥的没食子酸，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，以蒸馏水定容至50ml，制成0.3mg/mL没食子酸的溶液，作为对照品溶液。
将0.3mg/mL的没食子酸标准溶液分别配制成0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mL的溶液，分别取1mL置于10mL的容量瓶中，加入2 ml福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml 7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下，静置2h(Guo&Wei,2011)。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。于765 nm波长处测定吸光度值。
2.3.3标准曲线的制备
以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2。
表3-1：没食子酸标准曲线测定数据
图3-1：没食子酸标准曲线
2.3.4样品的测定
取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。取稀释后溶液1ml四份,分别置于10mL比色管中，加入2 ml福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml 7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下，静置2h。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。于765 nm波长处测定吸光度值。
总酚酸含量计算：
多酚含量（mg/100g）=
3.清除 DPPH·的能力的测定
3.1.实验仪器、药品及试剂
2.1.1 实验仪器
ALZO4型电子分析天平:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;
DELA犯O型pH计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;
723可见分光光度计:上海菩华科技仪器有限公司;
DK一512型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;
容量瓶(250mL，10OmL，25mL)、比色管(10mL);
烧杯、移液管、吸耳球。
3.1.2试剂及药品
DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）；
Vc（Ascrobic acid，维生素 C，抗坏血酸）为分析纯；
无水乙醇，蒸馏水
3.2.1配制DPPH溶液
配制0.06mMDPPH试剂，放入冰箱4℃进行冷藏，以备用。
3.2.2参照品Vc标准溶液的制备
准确称取17.6mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL的容量瓶中定容至刻度线及可以得到2mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、5、6ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L的溶液。从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的DPPH，反应30min,在517nm测出吸光值(Thoo&Ho,2010)，用无水乙醇代替待测液作为对照，用无水乙醇作空白，重复三组。
清除率=[(Ac-Ai)/Ac]×100%
式中，Ac：0.1 mL 无水乙醇加 3.9mL DPPH 溶液的吸光度；
Ai：0.1 mL 待测液加 3.9mLDPPH 溶液的吸光度。
3.2.3标准曲线的绘制
3.2.2测试数据及标准曲线的绘制
表3-1：VC标准曲线测定数据
以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2。
图3-1：VC含量与吸光度的关系
图3-1：VC含量与清除率的关系
3.2.4样品的测定
取提液4ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释2.5倍。取稀释后溶液0.1mL三份,分别置于10mL 试管中，再分别加入配置好的DPPH溶液3.9mL,摇匀，反应30min后，分别在517nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以Vc为参比）,三次结果取平均值。经换算后得样品自由基清除率。
4. 清除ABTS+自由基能力的测定
4.1ABTS+自由基的配制
准确称取0.19215gABTS于50mL的容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，浓度7mmol/L；7mmol/LABTS+.与2.45mmol/L的高硫酸钾等体积混合，在室温、避光黑暗的条件下静置过夜反应12~16h，形成 ABTS+ 自由基储备液。该储备液在室温，避光的条件下稳定。用前用无水乙醇稀释成工作液，于波长734nm处测得其吸光度为0.7000（±0.02），再装入棕色试剂瓶中，放入冰箱4℃进行冷藏，以备用。
4.2标准曲线的绘制
4.2.1参照品Vc标准溶液的制备及测试
准确称取8.8.mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线及可以得到1mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、5、6、7、8ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L的溶液。从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的DPPH，反应30min,在517nm测出吸光值，用无水乙醇代替待测液作为对照(Zhu&Lian,2011)，用无水乙醇作空白，重复三组。
清除率=[(Ac-Ai)/Ac]×100%
式中，Ac：0.1 mL 无水乙醇加 3.9mL ABTS+ 自由基溶液的吸光度；
Ai：0.1 mL 待测液加 3.9mLABTS+ 自由基溶液的吸光度。
4.2.2测试数据及标准曲线的绘制
表4-1：Vc浓度与吸光值和清除率的数据
图4-1Vc浓度与其吸光值的关系
图4-2：Vc浓度与其清除ABTS能力的关系
5.还原能力的测定
5.1实验试剂
磷酸盐缓冲溶液（配成PH6.6 0.2mol/l）;
K3Fe(CN)6溶液（配成1%）;
三氯乙酸（配成10%）；
FeCl3（配成0.1%）；
没食子酸
无水乙醇
5.2标准曲线的绘制
5.2.1试剂的配制
磷酸盐缓冲溶液(pH6.6 0.2mol/L)：准确称取7.16g的磷酸氢二钠至100mL的烧杯中用蒸馏水溶解后，置于100mL的容量瓶中用蒸馏水定容，即可得到0.2mol/L的磷酸氢二钠，同样的方法配制0.2mol/L的磷酸二氢钠。准确量取37.5mL的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和62.5mL的0.2mol/L磷酸二氢钠溶液至烧杯中，用pH校正既可以得到磷酸盐缓冲溶液(pH6.6 0.2mol/L)。
5.2.2标准溶液的配制及测试
用没食子酸做标准曲线其浓度范围在50—300ug/ml，准确称取50mg没食子酸到100mL烧杯中用无水乙醇溶解后，置于容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线，得到0.5mg/ml的母液，在分别取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL至10mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度先，得到50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml的溶液，取不同浓度的待测液或样品1ml于试管中，依次加入PH6.6磷酸盐缓冲溶液（0.2mol/l）2.5ml和1% K3Fe(CN)6溶液2.5ml后混合均匀，混合液于50℃水浴20min,再加入10%的三氯乙酸2.5ml。于（3000r/min）离心10min,取2.5ml的上清液再依次加2.5ml蒸馏水和0.1%的FeCl3 0.5ml混合均匀，静置10min在700nm处测定吸光值，通过在700nm下的吸收值来测量提取物的还原能力，吸光值越高表明还原力越强，EC50的计算是吸光值为0.5时的浓度（Roy&Laskar,2011）。
5.2.3测试数据及标准曲线的绘制
表5-1：没食子酸的质量浓度和吸光值的数据
图5-1：没食子酸的质量浓度与其吸光值的关系
6.超氧自由自测定
6.1实验试剂
1实验试剂
Tris-Hcl缓冲液（配制PH8.20 50mmol/L）
邻苯三酚(配制3mmol/L)
VC
无水乙醇
6.2标准曲线的绘制
6.2..1试剂的配制
Tris-HCl（pH8.2 50mmol/L）缓冲溶液：取0.6057g三羟甲基氨基甲烷（Tris），蒸馏水溶解定容至50mL容量瓶；取0.309mL分析纯盐酸溶液至100mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，即得0.1mol/L盐酸溶液；分别取配置好的Tris50mL和0.1mol/L盐酸溶液22.9mL于100mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，用pH计进行校正即可以得到Tris-HCl（pH8.2 50mmol/L）缓冲溶液。邻苯三酚：配制10mmol/L的稀盐酸，取0.310mL分析纯盐酸溶液至1000mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线；取焦性没食子酸0.0095g，至25mL的容量瓶中用10mmol/L的稀盐酸溶液定容至刻度线。
6.2.2标准溶液的配置及测试
精密称取Vc标准样品0.0300g置于100mL烧杯中,用纯净水溶解后定容至100mL 容量瓶中,即可得0.3mg/mL的Vc标准溶液。
将0.3mg/mL的Vc标准溶液分别配制成0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL，0.18 mg/mL,0.21 mg/mL,0.24 mg/mL,0.27 mg/mL,0.3 mg/mL的溶液，分别加入4.5mL的Tris-HCl（pH8.2 50mmol/L）缓冲溶液于10mL的试管中，再加入1mL不同浓度样品或待测液，25℃反应10min，再加入25℃预热的邻苯三酚0.1mL（3mmol/L用10mmol/L的盐酸配制），迅速摇匀，于325nm出测定，加入邻苯三酚即开始计时，每隔30s读取一次，至5min，做好记录。邻苯三酚的自氧化速率以无水乙醇代替样品，Tris-HCl缓冲溶液作空白。
清除率%=[(△Ac-△Ai)/△Ac]×100%
式中，△Ac：邻苯三酚自氧化速率；
△Ai：加入待测液后邻苯三酚自氧化速率。
6.2.3测试数据及标准曲线的绘制
表6-1：Vc的质量浓度与吸光值和抑制率的的数据
图6-1：Vc的质量浓度与其清除超氧自由基关系