综合设计性实验报告

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实验六   细胞培养

    ——小鼠表皮细胞的原代培养

 

摘要  目的 探讨体外分离和培养小鼠表皮细胞的方法。方法 采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠表皮细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠表皮细胞组织剪成小于1mm³大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将组织块接种于培养瓶中进行体外培养。）结果 新生小鼠表皮细胞克隆2~3d后开始形成^［1］，细胞呈梭形，体外培养一个星期后仍能够保持良好的生长状态。结论 采用该方法能够实现对小鼠表皮细胞的体外原代培养，并且细胞贴壁生长的速度比单纯采用酶消化法和组织块法大大提高。

关键词  原代培养 小鼠表皮细胞 酶消化法 组织块法

             

                                                     1前 言

目的 ：初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。意义 ：细胞培养技术目前已经广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学等领域，已发展成为一种重要的生物技术。为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。^［2］方法 ：结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。 结果 ：运用这种方法成功并比较快速地培养出原代表皮细胞 。结论 ：这种方法为广泛开展表皮细胞原代培养奠定了基础。

 

                 2实验原理

原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用组织块培养法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。

                               3实验用品

3.1器材

每小组：

解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管（如有条件，吸管最好由可消毒移液器及其Tip取代）：直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶（或细胞培养皿）：小组人数+1个；青霉素瓶及瓶塞：小组人数+2个（其中一个用于分装胰酶液）；血细胞计数板1块, 盖玻片; 2～5ml注射器及注射针头1套；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。分类彻底清洗、干燥、包装、消毒灭菌后备用（用于取材接种及培养）。

每大组共用：

用于分装培养用液：盐水瓶250 ml1个、100 ml2个（或100、50各1个），配套100

（或50ml）盐水瓶塞2个，1 ml刻度吸管2支，吸管胶头（小）2个，青霉素瓶及瓶

塞1个/小组。

用于无菌操作：不锈钢杯子1个（作废液缸）；解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装

消毒棉球），医用棉花、纱布，酒精灯1台、打火机1个。

用于装载及包装物品：有盖白瓷盘2个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装盖玻片)1个。

用于超净工作台内放置需多次使用的吸管：试管12支；试管架1个。

记号笔1支等。

3.2试剂

  3.2.1清洗用液：5%稀盐酸、1%稀盐酸、2%NaOH、洗洁精、单蒸水、三蒸水、清洗液 （用

浓硫酸和重铬酸钾配制、全班共用）等。

  3.2.2消毒剂（用前配制）：甲醛、高锰酸钾、新洁尔灭、75%酒精、碘酒、过氧乙酸等。

  3.2.3 培养用液：

    3.2.3.1 细胞培养用液（每大组100mL，用100mL盐水瓶装）：经过滤过的F10

（RPMI1640）培养基占80~90%、经过滤除菌的小牛血清占10~20%,加入经过滤除菌、终

浓度各为100国际单位的抗菌素。

    3.2.3.2细胞消化液（每小组1青霉素瓶，约5mL）：经过滤除菌的0.25%胰蛋白酶

或EDTA—胰蛋白酶液。

    3.2.3.3平衡盐溶液：不含钙、镁离子的Hank液：每组约50mL，用50（或100）mL

盐水瓶装。

3.3 材料：新生小白鼠

4实验方法

4.1技术路线 清洗玻璃仪器,胶塞→制备消毒棉球→包装分装培养液用液用品→消毒分装培养用液用品→分装培养用液→包装原代培养接种用品→实验时的准备工作如小组所示→打开腹腔，切取小鼠皮肤组织块→洗去血污 →剔除多余成份→剪成小于1mm³大小的组织块→胰蛋白酶消化组织块→接种组织块→贴壁→培养→观察和记录

4.2 实验步骤

1 玻璃仪器的初步清洗、开始培育小白鼠（第一批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口的情况等）

2 继续培养乳鼠（第二批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口的情况等），玻璃仪器的清洗（清洗液浸泡）、胶制品的清洗。

3 继续培养乳鼠（常规饲养工作）、完成清洗工作（包括各类物品）、制备消毒用棉球、包装分装培养用液用品。

4  继续培养乳鼠（常规饲养工作、留意小鼠的出生）、消毒分装培养用液用品、分装培养用液、包装原代培养接种用品。

5  消毒原代培养接种用品

6  细胞原代培养^［3］

    (1)洗手 操作者用洗涤剂刷洗双手→自来水冲净→新洁尔灭浸泡→进入无菌室

    (2)准备工作：

［1］操作者于超净台内用酒精棉球消毒双手，待酒精稍干后点燃酒精灯，然后用酒精棉球消毒工作面。

［2］去掉Hank液、细胞培养液、酶液的包装纸。

［3］打开试管、吸管胶头包装，将试管插（尽量斜插）入试管架

［4］取出需用的吸管（直、弯吸管各一支，刻度吸管一支）套上胶头，试管一支，插入相应的试管中。

      ［5］打开培养皿以及解剖工具手持端的包装

    (7)处死小鼠(脱臼法) →消毒（放入含75%酒精的烧杯中浸泡数秒）。将以处死消毒的小鼠转移至超净工作台内的培养皿盖内，背部朝上。培养皿倒扣于包装纸上待用。

(8)解剖取皮肤：用酒精棉球擦拭背部，在腰部后缘用解剖镊提起皮肤，用解剖剪呈T形剪开皮肤，再用眼科剪切取皮肤组织块，置于无菌培养皿中。

(9)用Hank液洗涤皮肤组织2次，吸去Hank。

(10)剪碎组织块：换另一套眼科剪将组织块剪成小于1mm³的组织块（大小尽量一致）。用Hank液洗涤，弃Hank液。

(11)酶消化：将胰蛋白酶液加入装有组织块的青霉素瓶中，盖紧盖子，置超净工作台内中消化5—10min，知道组织块变松软、粘稠状，颜色略变白色为止。

(12)将培养液直接加入盛有胰蛋白酶和皮肤组织块的青霉素瓶中，利用其中的牛血清终止酶消化的作用，弃去酶液和培养液的混合液。加入培养液重复此操作2—3次。

        (13)取一培养瓶，在培养瓶的上面做好标志（在瓶侧注明班、组别、姓名、材料名称等信息）

  (14) 用培养液湿润的吸管小心吸取组织块,轻轻吹出到培养瓶的培养瓶面内,按照一定的间隔和形式用弯吸管将植块排列好

   (15) 翻转培养瓶（培养面在上方），加入4ml的培养液。

(16) 将培养皿加盖封口,送入37度恒温箱内,静置（加入的培养液不浸泡植块，不从瓶口流出）

(17) 4小时后，待组织块充分贴壁后，翻转培养瓶使植块浸于培养液中且不漂浮；(18) 观察 至于37度培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：

［1］培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。

［2］细胞生长与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。

［3］培养液若变为桔红色，一般表示细胞生长良好。  

经过1～2天培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。换液时也要注意无菌操作（若经过1～2天培养后,若细胞生长情况较差或培养液变红,则需换液。

a  无菌室的准备工作如小组方案中所示

b  从37摄氏度培养箱中取出培养瓶，于超净工作台内吸去全部旧培养液

c  用平衡盐溶液轻缓漂洗培养物1～2次,弃平衡盐溶液

d  加入与换液前相同的量的培养液

e  放回原来的培养箱继续培养

若经2～3天后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长。每日观察结果用文字记录，换液也需记录，在整个培养过程的不同阶段（最少在前、中、后阶段）置倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录。

5实验结果

5.1.图片展示

   

图一:第二天小白鼠的皮肤组织的生长情况                

     

                           

                                        

                                                               生长情况（第一次换液后一天）   

 5.2.结果分析

形态学观察结果 分离的表皮细胞，在培养3h后即能够充分贴壁生长。

（1）  表皮细胞在生长的早期（24～48h）已有比较多的细胞进行了贴壁生长，细胞多数呈梭形，并且细胞状态较好（如图一所示）。这时，培养液变为橙黄色，证明细胞已生长。

6 结果分析与讨论

本实验结合酶消化法和组织块法成功地培养出小鼠表皮细胞，并且相对单一采用酶消化法或者组织块法细胞贴壁生长的速度要大大提高了。原因是因为皮片经胰蛋白酶消化后，表皮很容易从真皮上分离下来。此时基底细胞联接较松散，把组织块放置于培养瓶中培养时，基底细胞即可轻易地游离到培养液中，然后在培养瓶底部进行贴壁生长。^［4］而单纯的组织块培养没有经过酶消化，单个的细胞不易从组织块上脱落，因此细胞游离出来贴壁生长的速度比较慢。因此，通过该实验证明，经过酶消化进行的组织块培养的这种方法是一种改良后的细胞培养的方法，此方法培养的细胞不仅细胞贴壁生长速度快，而且细胞生长的状态也很好。因此本实验成功地探讨出了一种细胞培养的方法，为以后的细胞培养提供了一种更加简便、更为可靠的方法，为广泛开展表皮细胞培养提供了基础。

7 参考文献

[1]王丽娟,孙耀兰等.小鼠表皮干细胞的分离与培养.生物技术通讯,Vol.22 No.3 May,2011.

[2]杨汉民.细胞生物学实验.第二版. 北京:高等教育出版社，1997.

[3]薜庆善.体外培养原理与技术［M］. 北京:科学出版社.2001.

[4]王亮. 新生小鼠表皮细胞的培养. 日用化学工业，第1期， 20##年2月.

第二篇：细胞生物学实验-小鼠肝细胞原代培养

小鼠肝细胞原代培养

小鼠肝细胞原代培养

实验目的：

1.

2.了解并掌握原代细胞培养的相关原理了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法

实验器材：

二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。

小鼠肝细胞原代培养

原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。

原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。一般采用2-5代的细胞进行实验。当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。

小鼠肝细胞原代培养

原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。

组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。

组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。3.培养：通过生长繁殖，细胞可以从组织块边缘向四周游出，最终生长繁殖连成片，原组织块可以完全消失。

小鼠肝细胞原代培养

离散细胞原代培养：动物细胞在体内有严密的组织结构，多数组织的形态是固体结构，细胞与细胞或者细胞与细胞间质之间联系紧密，要得到大量的离散细胞就必须进行人工分离（消化培养）。也有部分组织的细胞自然状态下就是松散的，从体内取出后不用处理（如血细胞）或稍加处理（如脾细胞）就可以得到细胞悬液。细胞离散后由于每个细胞都能与支持物接触，营养供应均匀，因此适应快、增殖快、建系快。通常的离散细胞原代培养步骤为：取材、剪切、消化、接种。

原代培养的细胞往往在制备时含有很多细胞种类，这就需要对分离的细胞进行纯化，细胞纯化分为悬浮细胞纯化和贴壁细胞纯化。悬浮细胞纯化多使用密度梯度离心法和表面抗原法（需要固化的抗体，如各种细胞分离柱）。贴壁细胞纯化通常是细胞贴壁法（依据贴壁的快慢）和酶消化法（依据贴壁的细胞对消化酶的敏感程度不同）。

小鼠肝细胞原代培养

肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞，50个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有50万个。肝细胞为多角形，直径约为20微米，有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构：如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。

肝细胞具有多种功能且代谢旺盛，离体培养的大鼠肝细胞用于毒理学、药理学、生物化学及致癌作用等研究有许多优点。医学上常培养肝细胞作为理想的体外模型,在肝病研究、护肝药物的研发等诸多方面发挥着日益重要的作用。但肝细胞在体外增殖能力差，原代培养难以成功，故在一定程度上限制了肝细胞培养的广泛开展。制备离体肝细胞常用的方法有非酶分离细胞法、离体肝脏酶消化分离法以及在体肝脏酶灌注法。

小鼠肝细胞原代培养

实验步骤：

1.在玻璃培养皿中装满冰后倒置成冰台，同时取3个60mm培养皿，加入2毫升预冷的PBS，标记上1、2、3（1号和2号培养皿需要放在冰台上使用）。2.将麻醉过的小鼠平放在解剖台上，用乙醇擦洗其胸部及腹部。在小鼠的肋骨下沿胸骨方向剪一口，摘除小鼠的肝脏并转移到1号培养血中（注意一定不要弄破内脏，以免带来严重污染，解剖工具必须泡在75%乙醇中，用过即洗），剔除心脏上的结缔组织和血块后转入2号培养皿。3.彻底清洗肝脏后转入3号培养皿（用注射器冲洗肝脏内部至肝脏呈灰白色）。4.用解剖剪把肝脏切碎成1mm3大小后把含有组织块的溶液转入15毫升离心管。5.静置静置待组织沉淀后弃上清，加入5毫升胰蛋白酶，37℃孵育5分钟后加入几滴胎牛血清终止消化。6.用注射器的橡胶头轻轻研磨组织块成糊状，把含有组织的溶液用200目的尼龙筛网过滤到新的离心管中。7.1000转离心5分钟，缓慢吸去上清，用DMEM重悬后，1000转离心5分钟，尽量消除残留的胰酶（操作在细胞间的超净工作台中进行）。8.加入含20%胎牛血清的完全培养基重悬沉淀后，把肝细胞铺到培养皿中，于37℃、5%CO2条件下培养，24小时首次换液，以后每2天换液（操作在细胞间的超净工作台中进行）。

小鼠肝细胞原代培养

肝细胞接种培养4小时即可看到有部分细胞贴壁，24小时后细胞已基本贴壁，这时可以换液除去血细胞，3天左右培养瓶中出现成群的新生细胞集落并向周围生长。肝细胞刚接种时有两种形状：一种体积较小胞浆颗粒较多；一种体积较大胞浆透明。两种细胞均为圆形或椭圆形，培养5天时，细胞贴壁牢固，体积明显增大，伸展生长成上皮样并相互连接融合成片。一般为了帮助细胞贴附可以在培养器皿上先涂上一层胶原或者一些促贴附成份（如Matrix等）

小白鼠的解剖示意图

解剖时切勿打开腹腔，剪破消化道和内脏会带来严重污染

小鼠肝细胞原代培养

实验作业：

1.

2.

3.

4.为什么在消化组织块时加入胶原酶？200目的滤网作用是什么？为什么用注射器冲洗肝脏内部至肝脏呈灰白色？如果分离的肝细胞贴壁不牢，需要怎样来帮助肝细胞贴壁？