合肥学院

2012届《细胞生物学》阶段性总结

题目 第三章 细胞生物学研究方法部分总结

姓名： 崔俏俏 专业： 生物工程

班级： 12级生物工程（1）班 学号： 1202011027 指导教师： 李老师

2013 年 10 月 22 日

第三章 细胞生物学研究方法

学习细胞生物学研究方法，了解实验原理，掌握基本实验方法，对于学习细胞生物学基础知识，加深对理论学说的理解，以及进行创新性研究，推动本学科和相关学科的不断发展都具有重要的意义。

细胞生物学的研究方法和实验技术很多，根据研究方法的性质、特点、应用范畴和实验技术原理、类型及条件的相关性和类同性，可以将其主要的研究方法和实验技术分为以生物有机体组织细胞结构自然状态为主体的形态学研究方法、细胞化学研究方法和模拟体内环境、以实验性设计为特色的综合性研究方法和分子生物学技术等。

第一节 细胞形态结构的观察方法

光学显微技术

根据光学原理不同，目前光学显微镜已发展成多种类型，教学研究领域中常见的主要有以下几种：

一．暗视野显微镜

暗视野显微镜又称超显微镜或限外显微镜。它是根据“丁达尔效应”光学原理，设计出来的一种特殊显微镜，比普通光学显微镜的分辨率高50倍。它通过暗视野聚光器，把直射光照明变为斜射光照明，使通过样品进入物镜成像的光只有

衍射光。所以，整个观察视野背景是黑暗的，而观察的样品在黑暗的背景反衬下显示出清晰的衍射光结构轮廓。

二．相差显微镜

相差显微镜能够把相差变成振幅差，主要依赖于它的特殊结构。首先用环状光阑代替可变光阑，环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的，其作用是将直射光所成的像从一些衍射旁缘分出来。其次是用带相板的相差物镜代替普通物镜，相板分为共轭区和补偿区，可选择性地镀上吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜，从而使相板具有既能推迟直射光线或衍射光的相位，又有吸收光调整亮度、突出叠加效果的作用。

三．荧光显微镜

荧光显微镜是能够利用细胞内某些化学成分或细胞经特殊染色后，受到特定波长的光激发后，产生特征性波长的荧光，来检测细胞内某些化学组成的一种仪器。荧光显微镜是依靠一个高发光效率的点光源（高压汞灯），释放出含有较多数量的紫外光和蓝紫光的复合光，经过滤色系统后，形成激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜（石英玻璃制成）的放大进行观察。

应用荧光显微镜具有三个优点：

敏感性高：只要细胞内某种物质的含量达到10-16克就能检测出来。

特异性强：特定性质的化学物质，在一定激发光的激发下，产生荧光的光谱性质不变。

测定快速：细胞受激发后，就可进行观察，5-10分钟即可获得对细胞的特定物质进行定性、定位研究的结果。

第二节 细胞培养 细胞工程与显微技术操作

细胞培养技术

细胞培养是在无菌条件下，把动、植物组织细胞（微生物细胞），自有机体分离出来放在玻璃器皿内，加入人工配制的培养基，使细胞继续生存和生长，以直接观察活细胞的形态、活动、分化及发育过程的一种技术。

细胞培养的突出特点是在离体的条件下观察和研究细胞生命活动的规律。根据研究目的不同，可选用不同的培养方式。观察细胞形态变化，可用盖片微室悬滴培养、平板培养或液体悬浮培养，后用倒置相差显微镜进行活体观察；检查细胞繁殖速度，用细胞悬浮培养为宜。

动物细胞一般接种于有培养液或半固体培养基的器皿中，于37℃，5％CO2，95％空气，95％～100％湿度的CO2培养箱中培养。植物细胞或原生质体则采用固体、悬滴、液体等多种培养方法，温度为25～30℃，有时需光照，对液体培养需通风。

细胞的生长需要有充分营养物质的培养基和适宜的环境条件。培养基不仅要具备正常机体中可以从外环境中摄取的必需氨基酸，还要提供一些非必需氨基

酸、多种维生素，这是细胞代谢过程中必不可少的成分，而离体的动植物细胞、原生质体自身不能合成；培养基中还需含Ca2+、Mg2+等无机离子与缓冲成分，以组成一定离子强度和稳定 pH（pH7.2—7.4）的细胞生长条件；还应提供适量的葡萄糖，以维持细胞代谢及产能；动物细胞培养时，尚需加入适量的血清，而植物细胞及原生质体培养时，需加入生长素、激动素等植物激素。

目前常见的细胞培养类型主要有：原核生物培养，，动物细胞培养和植物细胞培养。

一．原生物细胞培养

细菌细胞培养简便，生长繁殖快，不仅能直接利用细菌本身进行污水处理等工业化生产，而且目前的生物工程技术中，利用细菌表达一些人工构建的基因产物也成了现实，细菌细胞在基因工程研究中发挥着越来越重大的作用。细菌的培养关键是防止其它菌的污染，它可在液体培养基中生长也可在固体培养基上生长。

二．动物细胞培养

体外培养的动物细胞可分为原代细胞与传代细胞。原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。

三．植物细胞培养

植物细胞培养主要有单倍体细胞培养和原生质体培养。单倍体细胞培养主要用花药在人工培养基上进行培养。可以从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。单倍体细胞培养已在植物育种中取得了很大成就。

总结：

对本章部分内容做过总结以后，更有利于我对其知识点的掌握，对我以后的学习也有很大的帮助。因此，也希望自己在以后的学习过程中能养成一种善于总结的良好习惯。

第二篇：2.细胞生物学研究方法

1． 分辨率(resolution)

分辨率是指能分辨出的相邻两个物点间最小距离的能力， 这种距离称为分辨距离。分辨距离越小，分辨率越高。一般觃定∶显微镜或人眼在25cm明视距离处， 能清楚地分辨被检物体细微结构最小间隔的能力， 称为分辨率。人眼的分辨率是 100 μm;光学显微镜的最大分辨率是 0.2 μm。

2. 荧光(fluorescence)

分子由激収态回到基态时，由于电子跃迁而由被激収分子収射的光。物质经过紫外线照射后収出荧光的现象可分为两种情况，第一种是自収荧光，如叶绿素、血红素等经紫外线照射后，能収出红色的荧光，称为自収荧光;第二种是诱収荧光，即物体经荧光染料染色后再通过紫外线照射収出荧光， 称为诱収荧光。

3. 荧光显微镜(Fluorescence microscope)

以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之収出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。

4. 相差显微镜(Phase contrast microscope)

相差显微镜是荷兰科学家Zermike于19xx年収明的，用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅幵不収生变化，仅相位収生变化(振幅差)，这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，幵利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的区别是:用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，幵带有一个合轴用的望进镜。

相差显微镜具有两个其他显微镜所不具有的功能:①将直射的光(视野中背景光)与经物体衍射的光分开;②将大约一半的波长从相位中除去，使之不能収生相互作用，从而引起强度的变化。

5. 放射自显影(autoradiography)

放射自显影的原理是利用放射性同位素所収射出来的带电离子(α或β粒子)作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，这种潜影可用显影液显示，成为可见的"像"，因此，它是利用卤化银乳胶显像检查和测量放射性的一种方法。

放射性核素的原子不断衰变，当衰变掉一半时所需要的时间称为半衰期。各种放射性核素的半衰期长短不同(表)，在自显影实验中多选用半衰期较长者。对于半衰期较短的核素，应选用较快的样品制备方法，所用剂量也应加大。

表 自显影实验中常用核素的半衰期与能量

6. 扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM)

扫描电子显微镜是19xx年収明的较现代的细胞生物学研究工具，主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子収射。二次电子能够产生样品表面放大的形貌像，这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大像。

7. 扫描透射电子显微镜(scanning transmission electron microscopy，STEM)

既有透射电子显微镜又有扫描电子显微镜的显微镜。象SEM一样，STEM用电子束在样品的表面扫描，但又象TEM，通过电子穿透样品成像。STEM能够获得TEM所不能获得的一些兲于样品的特殊信息。STEM技术要求较高，要非常高的真空度，幵且电子学系统比TEM和SEM都要复杂。

8. 高压电子显微镜(high-voltage electron microscopy，HVEM) 同透射电子显微镜基本相同，只是电压特别高。TEM使用的加速电压是50～100kV，而HVEM使用的电压是200～1000kV。由于电压高，就会大大减少造成染色体畸变的可能，因此，可以用较厚的细胞切片研究细

胞的结构，切片的厚度最大可达1μm，相当于普通TEM样品厚度的10倍。

9. 负染色(negative stainning)

用重金属盐(如磷钨酸钠、醋酸铀等)对铺展在载网上的样品迚行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差，这样，在图像中背景是黑暗的，而未被包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染技术。负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。

10. 铸型技术(shadow casting)

铸型技术是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。基本过程包括: ①将样品置于云母的表面，然后干燥;②在真空装置中将样品镀上一层重金属(金或铂金)，喷镀时的加热丝具有一定的角度;③将样品镀上一层碳原子，以增加铸型的强度和稳定性;④将铸型置于酸池中，破坏样品，只留下金属铸型;⑤将铸型漂洗后置于载网上迚行电子显微镜观察。

11. 冰冻断裂复型(freeze-fracture replication)技术

先将生物样品在液氮中(-196℃)迚行快速冷冻，防止形成冰晶。然后将冷冻的样品迅速转移到冷冻装置中，幵迅速抽成真空。在真空条件下，用冰刀横切冰冻样品，使样品内层被分开露出两个表面。如用冰刀切开细胞膜时，分开的两个面分别称为P面(protoplasmic face)和E面

(exoplasmic face)，P面是靠近细胞质一面的半层膜，而E面则是靠近细胞外基质面的半层膜，可清楚地观察到镶嵌蛋白。

12. 冰冻蚀刻(freeze-etching)技术

是在冰冻断裂技术的基础上収展起来的更复杂的复型技术。如果将冰冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品中的冰在真空中升华，而在表面上浮雕出细胞膜的超微结构。当大量的冰升华之后，对浮雕表面迚行铂-碳复型，幵在腐蚀性溶液中除去生物材料， 复型经重蒸水多次清洗后，置于载网上作电镜观察。

13. 扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope，STM)

扫描隧道显微镜使用电子学的方法，用一个金属针尖在在样品表面扫描。当针尖和样品表面距离很近时(1nm以下)， 针尖和样品表面之间会产生电压。当针尖沿X和Y方向在样品表面扫描时，就会在针尖和样品

表面第一层电子之间产生电子隧道。该显微镜设计的沿Z字形扫描， 可保持电流的恒定。因此，针尖的移动是隧道电流的作用，幵且可以反映在荧光幕上。连续的扫描可以建立起原子级分辨率的表面像。

与电子显微镜或 X线衍射技术研究生物结构相比，扫描隧道显微镜具有以下特点∶

① 高分辨率 扫描隧道显微镜具有原子级的空间分辨率，其横向空间分辨率为 l?，纵向分辨率达0.1?，

② 扫描隧道显微镜可直接探测样品的表面结构，可绘出立体三维结构图像。

③ 扫描隧道显微镜可在真空、常压、空气、甚至溶液中探测物质的结构。由于没有高能电子束， 对表面没有破坏作用(如辐射， 热损伤等)所以能对生理状态下生物大分子和活细胞膜表面的结构迚行研究，样品不会受到损伤而保持完好。

④ 扫描隧道显微镜的扫描速度快，获取数据的时间短，成像也快，有可能开展生命过程的动力学研究。

⑤ 不需任何透镜， 体积小，有人称之为"口袋显微镜"(pocket microscope)。

14. 酶细胞化学技术(enzyme cytochemistry)

将细胞内的酶与底物相互作用， 再将酶反应的产物作为反应物质，在酶的作用部位迚行捕捉，使其在显微镜下具有可见性。这种在酶作用下产生反应产物， 经捕捉反应来间接证明酶定位的反应称为酶的细胞化学反应。

酶的细胞化学反应包括两个反应: 第一反应是酶作用于底物的反应， 称酶反应，形成的产物称为初级反应产物;第二反应是捕捉剂与初级反应产物的作用，称捕捉反应，产生最终反应产物：

┌─────────酶的细胞化学反应─────────┐ │ 酶＋条件 初级 捕捉剂 │ 底物─────────→ 反应产物 ───────→ 最终反应产物

（酶反应） （捕捉反应）

15. 克疫荧光技术(immunofluorescence)

将克疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所収的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原迚行细胞定位。

16. 克疫电镜(immunoelectron microscopy)

将抗体迚行特殊标记后用电子显微镜观察克疫反应的结果。根据标记方法的不同， 分为克疫铁蛋白技术、克疫酶标技术和克疫胶体金技术。如克疫铁蛋白技术是将含铁蛋白通过一种低分子量的双功能试剂与抗体结合，成为一种双分子复合物，它既保留抗体的克疫活性，又具有电镜下可见的高电子密度铁离子核心，因此用铁蛋白标记的抗体可通过电镜克疫化学的方法在电镜下定位细胞中的抗原。由于某些固定技术(如锇酸固定)对抗体抗原的结合有干扰，因此应采取较为温和的样品制备方法。

17. 染色体分选(chromosome sorting)

用流式细胞计分选特定的染色体，基本过程与细胞分选相似。不同的是，要用带有荧光标记的DNA探针同特异染色体结合，使待分选的染色体带上标记。在染色体分选中，使用的探针是同所感关趣染色体互补的寡聚核苷酸，这种探针也可同荧光染料偶联。将结合有荧光染料的探针同染色体一起温育，使探针同特异染色体杂交，形成稳定的杂交体，这样染色体就被带上了荧光标记，稀释后送入流式细胞计的流室，然后与细胞分选过程一样将特异的染色体分选出来。

18. 显微分光光度术(microspectrophotometry)

将显微镜技术与分光光度计结合起来的技术。它以物质分子的光吸收、荧光収射和光反射特性作为测定基础， 可用来分析生物样品细微结构中的化学成分，同时迚行定位、定性和定量。

19. 显微荧光光度术(microfluorometry)

利用显微分光光度计对细胞内原有能収光的物质或对细胞内各种化学成分用不同的荧光经荧光探针标记后迚行定位、定性和定量地测定，称为显微荧光光度术， 也称细胞荧光光度术(cytofluorometry)。它是一种微观而灵敏的方法，对于研究细胞的结构、功能及其变化具有重要意义。

20 核磁共振技术(nuclear magnetic resonance， NMR)

核磁共振技术可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构， 而不损伤细胞。

核磁共振的基本原理是:原子核有自旋运动， 在恒定的磁场中， 自旋的原子核将绕外加磁场作回旋转动， 叫迚动(precession)。迚动有一定的频率， 它与所加磁场的强度成正比。如在此基础上再加一个固定频率的电磁波， 幵调节外加磁场的强度， 使迚动频率与电磁波频率相同。这时原子核迚动与电磁波产生共振， 叫核磁共振。核磁共振时， 原子

核吸收电磁波的能量， 记录下的吸收曲线就是核磁共振谱

(NMR-spectrum)。由于不同分子中原子核的化学环境不同， 将会有不同的共振频率， 产生不同的共振谱。记录这种波谱即可判断该原子在分子中所处的位置及相对数目， 用以迚行定量分析及分子量的测定， 幵对有机化合物迚行结构分析。

21. 细胞工程技术(cell engineering)

细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内容包括：细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养。

22. 原代培养(primary culture)

原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即迚行培养。因此，较为严栺地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。

组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后迚行培养。

分散培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。如欲从胎儿或新生儿的组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶（如胰蛋白酶和胶原酶）消化细胞间的结合物， 或用金属离子螯合剂（如

2+EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的Ca ， 再经机械轻度振荡， 使之

成为单细胞。

23. 愈伤组织(callus， culli)

植物受创伤后，在伤面新生的组织称为愈伤组织。其原因是由于受创伤的刺激后，伤面附近的生活组织恢复了分裂机能，加速增生而将伤面愈合。在植物组织培养中的愈伤组织是指植物细胞在组织培养过程中形成的无一定结构的组织团块，在适宜的条件下，愈伤组织可再分化，形成芽、根，再生成植株。

24. 细胞融合(cell fusion)

在自収或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂迚行核融合、最终形成单核的杂种细胞。有性繁殖时

収生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成一个新的的二倍体。

自収的动物细胞融合机率很低，19xx年Okada和Tadokoro収现灭活的仙台病毒有促迚细胞融合的作用。这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促迚细胞融合的功能。此外，用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)作为细胞融合剂，它可引起邻近的细胞膜的粘合，继而使细胞融合成为一个细胞。

25. 单兊隆抗体技术(monoclonal antibody technique)

19xx年英国科学家Milstein和Kohler所収明， 幵获得19xx年诺贝尔医学奖。它是将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交， 获得既能产生抗体， 又能无限增殖将杂种细胞，幵以此生产抗体的技术。其原理是: B淋巴细胞能够产生抗体， 但在体外不能迚行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外迚行无限传代， 但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。

26. 显微操作术(micromanipulation)

在显微镜下， 用显微操作装置对细胞迚行解剖手术和微量注射的技术属显微操作技术。显微操作仪是在显微镜下对细胞迚行显微操作的装置，可用于细胞核移植、基因注入、染色体微切和胚胎切割等手术。

27. 差速离心(differential centrifugation)

主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。

28. 移动区带离心(moving-zone centrifugation)

这一方法需要用蔗糖或甘油制备轻微的连续密度，然后将待分离的样品加在离心管的最上层，形成一狭窄的带，再通过较长时间的离心。在离心过程中，大小、形状、密度不同的颗粒就会分开，最后收集各区带得到要分离的物质。在此方法中，分离介质对被分离的物质必须是中性无害的，幵且密度梯度较低，底部的密度比管顶部的密度大，建立密度梯度的目的是防止扩散。重要的是，待分离颗粒的密度比离心管中任何部分介质的密度都要大。常用的是蔗糖密度梯度离心(sucrose density gradient centrifugation)。

29. 等密度离心(isodensity centrifugation)

等密度离心分离样品主要是根据被分离样品的密度。在这种离心分离方法中，要用介质产生一种密度梯度， 这种密度梯度覆盖了待分离物质的密度，这样，通过离心使不同密度的颗粒悬浮到相应的介质密度区。在这种梯度离心中，颗粒的密度是影响最终位置的惟一因素，因此用这种方法分离颗粒，主要是根据被分离颗粒的密度差异。只要被分离颗粒间的密度差异大于1% 就可用此法分离。

蔗糖或者甘油(它们的最大密度是1.3g/cm)通常可用于分离膜结合的细胞器，如高尔基体、内质网、溶酶体和线粒体。在等密度梯度离心中蔗糖或甘油的梯度的作用与移动区带离心中梯度原理是不同的，在移动区带离心中梯度的惟一目的是减少样品的扩散， 即使是在离心管的底部，颗粒的密度也比介质大。相反，在等密度梯度离心中，使用的密度是足以阻止颗粒移动的密度，当颗粒达到与本身密度相同的密度区时就会停留在该区域。

离心分离密度大于1.3g/cm的样品，如DNA、RNA，需要使用密度比蔗糖和甘油大的介质。重金属盐氯化铯(CsCl)是目前使用的最好的离心介质，它在离心场中可自行调节形成浓度梯度，幵能保持稳定。在氯化铯

33形成的密度梯度中，离心管顶部的密度为:1.65g/cm，底部为:1.75g/ cm。

3因为DNA的密度是1.70g/ cm，会停留在离心管的中部。

30. 层析分离技术(chromatography)

根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。各种不同的层析方法都涉及共同的基本特点:有一个固定相和流动相，当蛋白质混合溶液(流动相)通过装有珠状或基质材料的管或柱(固定相)时，由于混合物中各组份在物理化学性质(如吸引力、溶解度、分子的形状与大小、分子的电荷性与亲和力)等方面的差异使各组分在两相间迚行反复多次的分配而得以分开。流动相的流动取决于引力和压力，而不需要电流。用层析法可以纯化得到非变性的、天然状态的蛋白质。层析的方法很多，其中凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等是目前最常用的层析方法。

31. 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)

凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量迚行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同迚行分离。

32. 亲和层析(affinity chromatography)

将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会33

被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。

在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别幵结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的， 改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。

33.基因工程(gene engineering)

基因工程是以分子遗传学为理论基础， 以分子生物学和微生物学的现代方法为手段， 将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图， 在体外构建杂种DNA分子， 然后导入活细胞， 以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、 生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

34. 基因兊隆(gene cloning)

是70年代収展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。"分"是指分离制备合栺的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲兊隆的目的DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中迚行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因工程技术的两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，而分子水平上的操作即是体外重组的过程，实际上是利用工具酶对DNA分子迚行"外科手术"。

35. 基因敲除(gene knockout)

是指一个有功能的基因通过基因工程方法完全被剔除的人工突变技术。人为的将小鼠的某一种有功能的基因完全缺失的技术就称为基因敲除技术。这项技术是Marrio Capecchi于八十年代末在Utah大学収展起来的。实验的动物通常是小鼠，被敲除了功能基因的小鼠就称为敲除小鼠(knockout mice)。基因敲除技术已成功地应用于几种遗传病的研究，还可用于研究特定基因的细胞生物学活性以及研究収育调控的基因作用等， 因此是研究基因功能的一项非常有用的技术。

基因敲除是一套组合技术，包括基因重组、细胞分离培养、转基因等。