《病毒学》课程论文

Cell文章中的病毒学突破性发现

专 业：11级生物科学

姓 名：赵炳文

学 号：20114083051

日 期：20xx年6月

摘要：最新出版的《Cell》杂志（5月7日）中，由加州大学洛杉矶分校，中科院武汉病毒研究所等单位组成的研究小组的成员获得了病毒学方面的一项突破性发现：他们发现了无包被病毒在入侵细胞的过程中膜穿透蛋白的新机制，这一研究为解析此类病毒入侵细胞的特点，以及相关病毒性疾病的防治提供了重要信息。通过破坏内吞泡膜，通过在细胞膜上形成孔，通过溶酶体的作用，通过caveolae。通过破坏内吞泡膜 腺病毒感染宿主细胞时，首先通过纤维蛋白羧基端的结构域与其受体结合，继而，五邻体蛋白基座区中的RGD基团与另一种受体整合素av b3和av b5相互作用。对大多数腺病毒血清型而言，这种作用是随后病毒通过受体介导的内吞作用完成。

关键词：水生生物病毒；感染性亚病毒颗粒；糖膜穿透蛋白;超纯度病毒；腺病毒。 绪论

在这项研究中，加州大学洛杉矶分校的研究人员主要承担低温电镜与三维结构重构方面的工作，武汉病毒研究所的研究人员则承担超纯病毒样品的制备及分子生物学工作，为了更深入了解这一研究成果，生物通特采访了武汉病毒研究所主持这项工作的方勤研究员，就读者感兴趣的一些问题请教了她。方勤博士领导的研究组主要的研究方向是以水生生物病毒－草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)为研究模型，进行包括人类、哺乳动物、水生动物、植物、昆虫的dsRNA病毒的基因组与衣壳蛋白的结构与功能比较研究，探讨dsRNA病毒内源性转录复制机理以及病毒外衣壳蛋白在侵染过程中与宿主细胞的相互作用。生物通 过一些病毒，比如肠病毒及常见的引发婴幼儿腹泻的轮状病毒，由于没有包被，因此酒精，乙醚等的消除效果不佳，包括一些洗手液也是如此，所以了解这类病毒的侵入机制具有重要的意义，但是对于此类病毒的膜侵入机制更是少。

Cell文章中的病毒学突破性发现

在这一最新的研究中，研究人员采用单颗粒低温电子显微技术（single-particle

cryo-electron microscopy），首次获得3.3 ?原子水平的分辨率膜穿透蛋白VP5结构，并且通过分析这一结构，突破性的解析了在病毒入侵细胞过程中膜穿透蛋白的自动裂解是由稳定的休眠状态到起动（priming）状态的转换过程，为分析病毒侵入过程提供了宝贵的研究依据和资料。研究人员以一种水生呼肠孤病毒（Aquareovirus，Grass Carp Reovirus）为研究对象，通过低温电镜技术构建了感染性亚病毒颗粒（ISVP）包括6个蛋白在内的膜穿透蛋白VP5结构，揭示了病毒入侵细胞过程中膜穿透蛋白的自动裂解是由睡眠状态到priming状态转换的动态过程。[1] 在这个过程中，研究人员采用了单颗粒低温冷冻电子显微技术，对于这一技术的优点，方勤博士在采访中表示，大分子的晶体结构一般采用X射线衍射技术获得，但体外获得的结晶体并非为物质的自然构像。低温冷冻电镜技术的优点在于能够解析自然状态下物质的天然结构。虽然低温冷冻电镜技术用于生物大分子结构的研究已有十多年的历史，但过去的分辨率一般仅限于分子水平。要达到与晶体结构近似的原子水平分辨率，除低温电镜与重构技术需要改进外，最为关键的环节是超纯度病毒材料的获得。只有在低噪音条件下，才能获得高质量的Image[2]。此外，有关dsRNA膜穿透蛋白的原子结构，已有稳定状态下的晶体结构报道，但要获得亚稳状态下的ISVP膜穿透蛋白结构，用晶体

结构很难做到。通过破坏内吞泡膜 腺病毒感染宿主细胞时，首先通过纤维蛋白羧基端的结构域与其受体结合，继而，五邻体蛋白基座区中的RGD基团与另一种受体整合素av b3和av b5相互作用。[3]对大多数腺病毒血清型而言，这种作用是随后病毒通过受体介导的内吞作用完成内化所

（一）通过破坏内吞泡膜

腺病毒感染宿主细胞时，首先通过纤维蛋白羧基端的结构域与其受体结合，继而，五邻体蛋白基座区中的RGD基团与另一种受体—整合素av b3和av b5相互作用。对大多数腺病毒血清型而言，这种作用是随后病毒通过受体介导的内吞作用完成内化所需的。病毒借助整合素进行细胞内吞的过程需要激活磷脂酰肌醇-3-OH激酶

(phosphatidylinositol-3-OH kinase, PI3K)，PI3K再通过激活Ras和Rho信号转导系统，使细胞骨架发生改变来完成病毒的内化。在腺病毒通过内吞泡的形式从细胞表面向核膜转运的过程中，它经过一系列步骤来完成去包被。[4]在这个过程中，结构蛋白（如纤维蛋白、蛋白IIIa和VIII等）从衣壳中依次解离出来。蛋白VI在酸性的内吞泡中被降解，这可能是由病毒蛋白酶L3/p23完成的。该蛋白酶位于病毒颗粒的核心，在胞外的氧化性环境中没有活性。在进入内吞泡的还原性环境后，该蛋白酶被激活。而且，五邻体基座区与整合素受体的相互作用能导致五邻体蛋白构象的改变，暴露出蛋白VI上的L3/p23水解位点。在内吞泡酸化后，酸性环境促使五邻体蛋白基座区及蛋白IX也释放出来。五邻体蛋白基座区能介导内吞泡膜的溶解，并将残余的病毒释放入胞质。[5]除了病毒DNA、核心蛋白和少量的六邻体蛋白外，已失去大部分成分的衣壳被锚定在核孔复合体上。随后核蛋白被释放入核，病毒开始转录。腺病毒进入细胞的整个过程，即从开始胞吞到DNA释放入核，在370C时约需30分钟[6]。在此期间，病毒进行了一系列必须的改变。在这些改变中，一些由内吞泡的酸性环境诱导，一些由病毒蛋白酶的作用引起，而另外一些改变例如纤维蛋白的释放则可能是由于衣壳与受体的相互作用所致。腺病毒通过利用五邻体蛋白基座区这种酸激活的膜水解蛋白破坏内吞泡膜的方式来通过细胞膜。[7]

(二)通过在细胞膜上形成小孔

RNA病毒利用与腺病毒不同的机制来通过细胞膜。脊髓灰质炎病毒与其免疫球蛋白样受体PVR的相互作用使该病毒颗粒失去位于病毒内部的衣壳蛋白VP4，并使衣壳蛋白VP1中通常位于病毒内部的的氨基末端外在化。[8]改变后的脊髓灰质炎病毒颗粒具有疏水性，而且与细胞膜的亲和力增加。VP1的亲脂性氨基末端暴露后插入细胞膜，形成一个孔，将病毒RNA释放到胞质中。[9]目前尚不清楚脊髓灰质炎病毒RNA的释放发生在细胞膜还是在内吞泡中。Bafilomycin A1可以抑制质子转运到囊泡中，因而能阻断内吞泡的酸化。然而，这种药物对于脊髓灰质炎病毒的感染没有影响。相反，这种药物能完全抑制穿透酸化的内吞泡膜而释放到胞质中的病毒对细胞的感染，例如流感病毒、西门利克森林病毒和水疱性口炎病毒等。[10]另外，脊髓灰质炎病毒与其抗体形成的复合体能

与表达Fc受体的细胞结合，但不能感染这些细胞。Fc受体能被胞吞，因此脊髓灰质炎病毒与PVR的相互作用是诱导导致病毒去包被的构象改变所需的。[11]

(三) 通过溶酶体的作用

大多数通过受体介导的胞吞作用进入细胞的病毒在囊泡到达溶酶体之前就已经释放到胞质中了。这种现象并不奇怪，因为溶酶体中含有可降解病毒颗粒的蛋白酶和核酸酶。然而，呼肠病毒科家族成员却能够到达溶酶体并利用这些蛋白酶和核酸酶来脱去其衣壳。呼肠病毒是一种二十面对称的双链RNA病毒，其基因组分为10个节段。病毒衣壳是一种双层结构，由8种不同结构蛋白组成。[12]呼肠病毒通过蛋白s1与受体结合，并通过胞吞作用被内化入宿主细胞。呼肠病毒对Bafilomycin A1敏感，表明这些病毒需要内吞泡的酸化来进入细胞。[13]酸性环境能激活溶酶体中的某些蛋白酶，作用于病毒蛋白。例如，病毒蛋白被糜蛋白酶消化，丢失外壳蛋白s3，且mIC在内蛋白的作用下裂解，形成具有感染性的亚病毒颗粒。这些亚病毒颗粒能穿透溶酶体膜并进入胞质，随后释放出病毒核心，启动病毒mRNA的合成[14]。亚病毒颗粒的感染性对Bafilomycin A1不敏感，说明亚病毒颗粒进入胞质的过程并不依赖于pH值的下本文通过低温冷冻电镜技术，在获得高分辨率重构的ISVP结构基础上，解析了ISVP外衣壳蛋白VP5在脱去其保护蛋白VP7动态状态下的原子结构，同时采用生物化学与分子生物学实验验证了其相应的功能。[15]

病毒入侵研究对于了解病毒传染，疾病防治具有重要的意义。对于这一领域未来的发展趋势，方勤博士也有自己的见解，她认为未来的方向主要是通过揭示无胞膜病毒侵入细胞的分子机制，制定相应的对策，以阻断病毒侵入途径，达到防治病毒感染的目的，要实现这一目标，其研究工作有待进一步深入。

参考文献：

[1] Cell：首次证实四十年病毒包装理论(05-14

[2] Nature子刊：抗病毒防御的起始信号(05-09)

[3] mBio：首次发现企鹅携带新型禽流感病毒(05-08)

[4] 《ACS Nano》：传递癌症治疗药物的“双锁”病毒(05-08)

[5] ·PNAS：解开19xx年流感大流行的奥秘(04-30

[6] Knipe D M, Howley P M. Fields Virology.Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins,2001. 1787～1833

[7] ayaram H, Estes M K, Prasad V B V, et al.Emerging themes in rotavirus cell entry, genomeorganization, transcription and replication.Virus Research, 2004, 101(1): 67～81

[8] Pesavento Joseph B, Lawton Jeffrey A, Estes MaryE, et al. The reversible

condensation and expan-sion of the rotavirus genome. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United Statesof America, 2001, 98(4): 1381～1386

[9] 姚英民;欧巧群;陈瑶;;轮状病毒感染全身扩散诱发因素的初探[J];南方医科大学学报;20xx年10期

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rotavirus entryinto cells but is not necessary for rotavirusattachment. Journal of Virology, 2002, 76(3): 1109～1123

[12] Graham Kate L, Halasz Peter, Tan Yan, et al. Inte-grin-using rotaviruses bind α2β1 integrin α2 I do-main via VP4 DGE sequence and recognize αXβ2 and αvβ3 by using VP7 during cell entry. Journal of Virology, 2003, 77(18): 9969～9978

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第二篇：病毒学复习资料

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第一章 绪论

一，病毒学研究的对象及任务

病毒（virus)是指那些在化学组成和增殖方式上独具特点的，只能在宿主细胞内进行复制的微生物或遗传单位。

病毒性质的两重性

1. 生命形式的两重性：

存在形式：化学分子与细胞内寄生、结晶体与非结晶体、颗粒体形式与基因形式。 2结构和功能的两重性：

标准病毒与缺陷病毒

缺陷病毒：装配不完全的病毒（缺损病毒，defective virus,Di颗粒）； 标准病毒：产生缺陷病毒的原亲代病毒）。

假病毒与真病毒

假型病毒：一种病毒的核酸被另一病毒外壳包裹；假病毒：细胞DNA被病毒外壳包裹；

真病毒：一种病毒的外壳包裹自己的核酸）。

杂种病毒与纯种病毒

杂种病毒：在混合感染中，病毒外壳包裹两种病毒的核酸

3病理学两重性：致病性与非致病性；急性感染与慢性感染

过客病毒：某一病毒对宿主无致病性，则该病毒称为此宿主的过 客病毒 病原病毒：某一病毒对宿主有致病性，则该病毒称为此宿主的病原病毒

亚病毒

1 卫星病毒与卫星核酸

satellite virus需辅助病毒才能复制核酸（卫星病毒），或由辅助病毒提供外壳蛋白来包被核酸（卫星核酸）

2 拟病毒 virusoid比卫星病毒核酸还要小，仅200—400bp，最大不过1kb环状RNA。需辅助病毒才能复制，与辅助病毒同包一个外壳中。属植物病毒，目前归于环状卫星RNA。

3 类病毒 viroid 240—375bp单链、环状RNA；独立侵染、自立复制、无外壳，多二级结构，不编码任何蛋白，为植物病毒

4 朊病毒 prion 很小的具侵染性的蛋白颗粒

病毒学研究的任务

1.防治和控制疾病

2.基础理论研究：生命起源与进化、认识生命本质

3.利用病毒造福人类：生物防治、病毒基因工程

病毒学发展趋势

一、病毒功能基因组学和蛋白质组学研究

1.从核酸及蛋白质水平认识病毒，了解它们的致病机理与诊断防治。

2.系统生物学理论的建立：系统生物学是研究一个生物系统中所有组成成分（基

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因、mRNA、蛋白质等）的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系的学科。也就是说，系统生物学不同于以往的实验生物学——仅关心个别的基因和蛋白质，它要研究所有的基因、所有的蛋白质、组分间的所有相互关系。显然，系统生物学是以整体性研究为特征的一种大科学。

3. 新的诊断/预防/药物的发展与利用

二、新出现或再现的病原微生物的特性与诊断、防治

近年新出现或再现病毒的特点

1. 多数为人畜共患病的病原，可能由动物传给人

2. 可能由昆虫或节肢动物为中间媒介

3. 随交通旅行或工作生活习性改变、环境气候变化而传播

4. 所致疾病的诊断需作病原学确证

三、病毒分子病理学研究

1. 生命起源、变异、毒力改变、进化

2. 病毒与宿主的相互作用

3. 肿瘤病毒学

第二章 病毒的分类与命名

病毒“种”是指构成一个复制谱系( replicating lineage) 、占据一个特定小生境(ecological niche) 、具有多个分类特征的病毒。

病毒属是一群具有某些共同特征的种。其属名的词尾“virus”,但在设立一个新的病毒属时必需有一个同时被承认的代表种(type species)。

病毒科是一群具有某些共同特征的属，科名的词尾为“viridae” 。

病毒目：是目前最高的分类阶元。病毒目是一群具有某些共同特征的科,目名的词尾为“virales”。

病毒分类原理及其依据

原理：强调其分类和命名的稳定性、实用性、认可性和灵活性。

稳定性是指病毒名称及其隶属关系一旦确定下来，就应该尽可能的保留。实用性是指病毒分类体制应该对病毒学研究领域是有用的。认可性是指病毒分类阶元和名称应该为病毒学研究者乐意接受和使用，所以，认可性也是实用性的必然结果。灵活性是指病毒分类阶元可以依据某些新发现而进行重新修订和再确定。 依据：主要以病毒粒子特性、抗原性质和病毒生物学特性等作为依据。

病毒粒子特性：

① 病毒形态：如大小、形状、包膜和包膜突起的有无，衣壳结构及其对称性 ② 病毒生理生化和物理性质：如分子量，沉降系数，浮力密度，病毒粒子在不同pH、温度、Mg2+、Mn2+、变性剂、辐射中的稳定性

③ 病毒基因组：如基因组大小、核酸类型、单双链、线状或环状，正负链，G+C所占的比例、核苷酸序列等

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④ 病毒蛋白：如结构蛋白和非结构蛋白的数量，大小以及功能和活性，氨基酸序列等；

⑤ 病毒脂类含量和特性；

⑥ 碳水化合物含量和特性；

⑦ 病毒基因组组成和复制：基因组结构、复制策略、开放阅读框数量和位置、转录转译特性、转译后加工、病毒蛋白聚集和病毒组装的位置，病毒成熟与释放的部位和特性

第三章 病毒学的研究方法

一、病毒学研究常用方法

离心技术：差速离心法：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。密度梯度离心：采用甘油，蔗糖，氯化铯配制成抗对流干扰连续密度梯度介质，把病毒粒子和杂质沉淀或浓缩到与它自身密度相等的位置。

电子显微镜技术：负染色法；超薄切片技术；免疫电镜技术；冷冻电镜技术 组织和细胞培养技术：

组织培养法 (tissueculture) 或细胞培养 (cellculture)法,是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。

群体培养: 将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层。

克隆培养: 将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。

原代和次代细胞培养：分离病毒最为敏感。

二倍体细胞 ：用于病毒分离和疫苗制备

传代细胞系 ：用于病毒的分离鉴定和抗病毒药物筛选研究。常用的细胞系有人宫颈癌细胞（Hela）、传代地鼠肾细胞（BHK21）、人喉上皮癌细胞（Hep-2）、传代非洲绿猴肾细胞（Vero） 。

病毒基因转染细胞系：用于病毒基因调控和抗病毒药物的研究。

细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）：由病毒增殖引起的细胞改变，称细胞病变效应。

不同种类病毒可引起

①细胞圆缩、分散、溶解，如肠道病毒、鼻病毒、披膜病毒、痘病毒等； ②细胞融合成多核巨细胞，如疱疹病毒、副粘病毒、呼吸道合胞病毒； ③细胞肿胀、颗粒增多、病变细胞聚集成葡萄状，如腺病毒；

④胞质出现空泡，如SV40细胞；

⑤细胞浆或核内出现嗜酸性或嗜碱性包涵体，一至数个不等，如狂犬病毒和巨细胞病毒；

⑥轻微病变，如正粘病毒、狂犬病毒、冠状病毒和逆转录病毒等；⑦培养液pH的变化。

细胞培养特点：

1. 细胞的变化

① 有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为细胞病变效应

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(CPE)。常见的变化有细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。

② 有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于细胞膜，可使邻近的细胞相互

融合，形成多核巨细胞或称融合细胞。

③ 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培养细胞中形成胞浆或核内

的包涵体。

2.红细胞吸附 (hemadsorption,HAd)：流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎动物 (豚鼠、鸡、猴等) 红细胞的能力，这一现象称红细胞吸附，常用来测定具有HA的粘病毒与副粘病毒的增殖。若有相应的抗血清，则能中和细胞膜上的HA，HAd不再发生，称红细胞吸附抑制试验。

3.干扰现象(interference)：某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易于测出的变化(如HAd)，但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖。如风疹病毒感染Vero细胞时CPE不明显，但它能干扰后感染的埃可病毒 (ECHOV) 的增殖，从而阻抑后者所特有的CPE

4.细胞代谢的改变：病毒感染细胞的结果可使培养液的pH值改变，说明细胞的代谢在病毒感染后发生了变化。这种培养环境的生化改变也可作为判断病毒增殖的指标。

1.蚀斑测定是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作蚀斑形成单位 (plaque forming unit,PFU)。病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFU／ml表示。

2.50%组织细胞感染量 (TCID50)测定法该方法是测定病毒能使50%的组织培养细胞发生感染的最小量。一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等指标，以最高稀释度能感染50%细胞的量为终点。最后用统计方法计算出50%组织细胞感染量（ 50% tissue culture infectious dose,TCID50)。

血清学方法

中和试验：适用于病毒鉴定，机体中抗体的检测，分析病毒抗原的性质，疫苗接种效果评估等。补体结合试验。

血凝抑制试验：常用于正粘病毒和副粘病毒感染的诊断和病毒亚型鉴定及抗原变异的监测，如流感病毒的分型。

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。

放射免疫试验（radio immunol assay，RIA）。

免疫荧光检测（immunofluorescence assay，IFA）。

凝胶扩散法（gel-diffusion test)

分子生物学方法

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。

转印杂交 ：Southern blot、Nouthern blot和Westhern blot。

蛋白质组学：肽图谱。

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基因组学：核酸序列测定及基因功能。

基因工程：抗病毒疫苗或抗病毒的大分子多肽 、病毒载体。

病毒的鉴定：

病毒的纯化：离心。

病毒的大小和形态：电镜。

细胞培养核酸类型鉴别和序列测定：PCR。

乙醚敏感试验：是否具有脂类包膜。

血清学反应：免疫荧光抗体技术

（三）病毒感染的快速诊断

快速诊断主要是指从含有病毒标本及感染机体的血清中检测病毒颗粒、蛋白抗原、IgM抗体和核酸等，往往在数小时内即可得出结果。

形态学检查 ：光学显微镜检查 ：包涵体 电子显微镜检查

病毒抗原检测： ELISA

病毒核酸检测 ：核酸杂交、凝胶电泳技术 、PCR

血清学诊断：

病毒蛋白抗原检查

用荧光素、放射性同位素、过氧化物酶等标记抗体，采用免疫学和分子生物学技术，检测标本中的病毒蛋白抗原，具有敏感、特异、快速等优点。

1.免疫荧光技术 (immunofluorescence,IF)

2.固相放射免疫测定 (solid-phase radioimmunoassay,SPRIA)

3.酶免疫技术 (enzyme immunoassay,EIA)此法可检测多种病毒及其抗体，主要是酶免疫组化法和酶联免疫吸附试验法(ELISA)。

特异性IgM抗体的检测

检测病毒特异性IgM抗体可诊断急性感染，特别是对证实孕妇感染风疹病毒尤为重要，但应注意类风湿因子 (IgM) 的干扰。另外，检测早期抗原的抗体是快速诊断的另一途径。如检测针对EBV的早期抗原(EA)、核心抗原 (EANA) 和衣壳抗原 (VCA) 等的抗体，可以区别急性或慢性EBV感染。此外，分子生物学检测技术、气相色谱技术等，均可用来分析和鉴定病毒感染。

检测病毒核酸

1.核酸杂交技术 用于病毒检测的有斑点杂交、细胞内原位杂交 、DNA印迹杂交、RNA印迹杂交等。

2.核酸扩增法 目前多数病毒基因已通过分子克隆技术被明确了核苷酸序列，使得DNA扩增技术逐步发展为常规诊断技术之一。

3.基因芯片技术 又称DNA芯片、生物芯片（biochip）。其原理是：将已知的生物分子探针或基因探针，大规模或有序排布于小块硅片等载体上，与待测样品中的生物分子或基因序列相互作用和并行反应，在激光的激发下，产生的荧光谱信号被接受器收集，计算机自动分析处理数据并报告结果。其优点是：可以一次性完成大量样品DNA序列的检测和分析，解决了传统核酸杂交技术的许多不足。芯片技术在病毒等微生物学诊断和流行病学调查方面有着广阔的应用前景。

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第四章 病毒的结构

一、病毒的大小表示形式：

分子量：核蛋白分子（核酸与蛋白质以一定方式组合），3～800×106 道尔顿 密度：浮力密度（ρ）→采用密度梯度离心方法测定，需注明介质沉降系数：单位离心力作用下的沉降速率（s）

壳体：由蛋白质组成，包围病毒核酸的蛋白质结构。颗粒→蛋白质亚基（不同的蛋白质）以次级键形式形成 。

核衣壳：由核酸与蛋白质壳体组成的核心成分

包膜：围绕或包围核衣壳的双分子层,来源于宿主，不同的病毒感染同一宿主包膜成分相同。 包膜突起→钉状物→糖蛋白组成复杂的病毒成分

二、病毒的结构与功能

病毒的结构有二种，一是基本结构，为所有病毒所必备；一是辅助结构，为某些病毒所特有。它们各有特殊的生物学功能。

基本结构：病毒核酸、病毒蛋白质

辅助结构：包膜、突起（脂质、糖类等）

病毒的化学组成:核酸、蛋白质、脂类、碳水化合物、无机盐

病毒基因组的结构特点

1.病毒基因组大小相差较大。

2.病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成。

3.多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成，还没有发现有节段性的DNA分子构成的病毒基因组。

4.基因重叠

5.病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的。

6.病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位,形成一个功能单位或转录单元。

7.除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次。

8.噬菌体（细胞病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的，具有内含子。

病毒核酸的结构特征

(1)粘性末端

(2)末端冗余

(3)循环排列

(4)回文序列

(5)倒转末端重复序列 是指存在于病毒基因组两端的反向互补重复序列，这样的基因组经过变性、退火处理，可以形成有部分双链区的线状环；或者产生锅柄样的结构。

(6)重叠基因

(7)分段基因组：

单分体病毒：多个核酸节段包装在同一病毒粒子中

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多分体病毒：多个核酸节段分别包装在不同的病毒粒子中，这类病毒实际上是由几个不同的病毒粒子所组成的复合体。

含分段基因组的病毒具有以下三个特点：侵染效率低；容易产生变异；具有较高的重组率。

多分体现象为植物病毒所特有，并仅存在于＋ssRNA病毒中，是指病毒的基因组分布在不同的核酸链上，分别包装在不同的病毒粒体里。

双分体病毒指遗传信息为双组分基因组包被在两种粒体里的病毒，如烟草脆裂病毒属(Tobravirus)和蠕传病毒属(Nepovirus)。

三分体病毒指核酸包被在三种粒体中的病毒。

(8)帽子和ploy(A)结构 真核病毒的正链RNA基因组、双链RNA基因组的正链RNA和病毒的mRNA通常有类似于真核生物mRNA 5’端的帽子结构和3’的poly(A)结构尾。而原核生物mRNA和相应的噬菌体基因组RNA均缺少这样的结构。 病毒基因组RNA 5’端的帽子结构有着真核生物5’端的帽子结构的相似功能，它对病毒基因组正链RNA具有保护作用，可以使病毒正链RNA或mRNA免受宿主细胞中的外切核酸酶的降解；病毒基因组RNA的帽子结构还与感染性有关，缺少它几乎完全丧失感染性。

病毒基因组的3’的poly(A)结构尾有多方面的功能。 保持和提高病毒基因组RNA在宿主细胞中的稳定性； 3’的poly(A)结构尾也与病毒的侵染性有关。

(9)其它特征 一些真核DNA病毒基因组还含有复制原点序列以及转录调控序列如启动子和增强子序列。某些真核病毒的基因组也含有内含子

转染：从病毒中提取核酸，来进行遗传物质的传递，感染细胞。

转染可分核酸为

① 侵染性核酸

②非侵染性核酸 。具有RNA功能活性，进入细胞以后直接作为翻译的模板，合成大分子蛋白质，叫侵染性核酸。

核酸的组成、含量与类型

组成： A T C G ；A+G=T+C

类型：DS DNA ：SS DNA ；DS RNA；SS RNA

含量：不同病毒含量差异较大（P50)

核酸的极性 将mRNA 的碱基排列顺序规定为(+ RNA ) 链, 其相应的模板链则为负链(- DNA ) , 因此只有负链DNA 才能被转录并产生mRNA。也就是说凡碱基排列顺序与mRNA 相同的单链DNA 或RNA , 称(+ )DNA 链或(+ )RNA 链, 凡碱基排列顺序与mRNA链互补的单链DNA 和RNA , 称(- )DNA 链或(- )RNA 链

结构蛋白质：要形成完整，成熟，有感染性病毒粒子的蛋白质成分 ,包括：壳体蛋白、包膜蛋白、酶

非结构蛋白质：是由病毒基因编码，并不存在于病毒中，主要在病毒复制过程中发挥作用

非结构蛋白：病毒本身基因组所形成，与病毒核酸复制有关，病毒感染宿主后，形成的前体蛋白或早期蛋白。

结构蛋白的几种成分

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1.衣壳蛋白：构成病毒壳体的蛋白质，由一条或多条多肽链折叠形成的蛋白质亚基，是构成壳体蛋白的最小单位。

单一：一种亚基

复杂：几种亚基

功能：①构成病毒的壳体，保护病毒的核酸。②无包膜病毒的壳体蛋白参与病毒的吸附、进入，决定病毒的宿主嗜性，同时还是病毒的表面抗原。

抗原性质：有些可凝聚血细胞（血细胞凝聚特性）

2.包膜蛋白：

构成病毒包膜结构的病毒蛋白质，包括包膜糖蛋白和基质蛋白两类。

包膜糖蛋白类似于壳体蛋白（无包膜）的功能 与病毒吸附侵入，抗原性，血细胞凝聚特性。

基质蛋白：非糖基化蛋白，主要识别病毒核壳，在病毒核壳与包膜间起桥梁作用

3.酶：来源于病毒本身基因组功能表达的蛋白质分子，在病毒复制起作用

4.病毒的脂质：

许多病毒包膜内存在有脂类化合物，如磷脂、脂肪酸、甘油三酸脂和胆固醇等。这些脂类几乎都是由病毒粒子在细胞内成熟，在细胞膜处以芽生方式释放，直接从寄主细胞膜上得到。病毒脂类存在与病毒的吸附和侵入有关。

囊膜（Envelope）：某些病毒，如虫媒病毒、人类免疫缺陷病毒、疱疹病毒等，在核衣壳外包绕着一层含脂蛋白的外膜，称为“囊膜”。囊膜中含有双层脂质、多糖和蛋白质，其中蛋白质具有病毒特异性，常与多糖构成糖蛋白亚单位，嵌合在脂质层，表面呈棘状突起，称“剌突(Spike)或囊微粒(Peplomer)”。它们位于病毒体的表面，有高度的抗原性，并能选择性地与宿主细胞受体结合，促使病毒囊膜与宿主细胞膜融合，感染性核衣壳进入胞内而导致感染。囊膜中的脂质与宿主细胞膜或核膜成分相似，证明病毒是以“出芽”方式，从宿主细胞内释放过程中获得了细胞膜或核膜成分。有囊膜病毒对脂溶剂和其他有机溶剂敏感，失去囊膜后便丧失了感染性。

5.病毒的糖类：除病毒的核酸中所含戊糖外，有的病毒还含有少量的其他糖类，为核糖或脱氧核糖和磷酸组成的核酸骨架。有包膜病毒中碳水化合物以寡糖侧链的形式与蛋白质结合形成包膜糖蛋白。

6.其它组成：在某些动物、植物病毒中存在多胺类有机阳离子，包括丁二胺、亚精胺、精胺等，它们大都结合于病毒核酸，对核酸的构型有一定影响。在某些病毒的病毒体中，还发现有其它的小分子量组份，如ATP，对噬菌体尾鞘收缩提供能量。

病毒蛋白质衣壳的功能

（1）致密稳定的衣壳结构除赋予病毒固有的形状外，还可保护内部核酸免遭外环境（如血流）中核酸酶的破坏；

（2）衣壳蛋白质是病毒基因产物，具有病毒特异的抗原性，可刺激机体产生抗原病毒免疫应答；

（3）具有辅助感染作用，病毒表面特异性受体 边连结蛋白与细胞表面相应受体有特殊的亲和力，是病毒选择性吸附宿主细胞并建立感染灶的首要步骤。

三、病毒粒子的对称性

病毒的壳体结构→决定了整个病毒体的结构形状

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衣壳是由许多“壳微粒(Capsomere)”按一定几何构型集结而成，壳微粒在电镜下可见，是病毒衣壳的形态学亚单位，它由一至数条结构多肽能成。①立体对称②螺旋对称③复合对称

第五章 病毒的感染性繁殖

一、研究病毒复制的一般性方法

1、建立病毒复制的实验研究系统

无论是哪种培养系统，都要考虑：

①宿主细胞的敏感性与生理状态

②注意感染复数 病毒感染宿主细胞后，会导致宿主细胞出现裂缝，胞内的物质渗漏，使宿主细胞死亡。 要尽可能做到感染复数为1，即一个对一个。

感染复数(multiplicity of infection, m.o.i) ：用以起始病毒感染的每个细胞所需的病毒颗粒数目。单位（PFU/cell）

2、一步生长实验

取样，分别测定溶液的感染效价，以培养时间为横坐标，感染效价为纵坐标，画出一步生长曲线，体现3个特征：①潜伏期②增长期③稳定期

潜伏期中包含有隐蔽期，隐蔽期是有感染性的病毒粒子从消失到出现这段时期。

3、成熟前的裂解

病毒如何体现生命特征：病毒吸附寄主细胞后，核酸进入胞内，病毒的基因组利用宿主细胞的大分子合成装置，进行核酸的复制和基因组的表达。

二、病毒的增殖

病毒复制周期

1. 吸附（Adsorption）指病毒附着于敏感细胞的表面，它是感染的起始期。细胞与病毒相互作用最初是偶然碰撞和静电作用，这是可逆的联结。随后的特异性吸附是非常重要的，根据这一点可确定许多病毒的宿主范围，不吸附就不能引起感染。接触→结合→特异性吸附（病毒配体位点与细胞膜特异受体结合）. 能否吸附成功取决于：环境因子、病毒吸附蛋白VAP、细胞受体

2. 侵入（Penetration）:注射式侵入、细胞内吞、膜融合以及其他特殊的侵入方式。注射：有尾噬菌体的侵入方式。吸附→尾钉固着→尾鞘收缩→尾管穿入→DNA注入。

3. 脱壳（uncoating）

4. 生物合成（biosynthesis）

转录的调节

① 可利用宿主的转录酶进行转录，某些噬菌体本身携带转录酶，当转录酶与DNA

进入细胞后，转录即刻开始，小的DNA噬菌体完全依赖宿主的转录酶。

② 某些噬菌体线形DNA以极性的方式进入胞内，由于固定一端的部分侵入，可

以导致不同的基因依次被转录。

③ 在同一转录单位的基因相继转录，靠近启动子的基因优先转录。

④ 宿主转录酶的修饰，可以改变它与调节亚基的相互作用。

⑤ 噬菌体因子与宿主转录酶的结合可以改变转录起始与终止的特异性。 ⑥ 噬菌体DNA出现单链的缺口或间隙可以改变它的模板性质。

⑦ 不同噬菌体的mRNA的功能活性持续的时间有别。

⑧ 噬菌体的多顺反子的mRNA切割成小mRNA。

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DNA噬菌体的大分子物质的调节 ：mRNA的5’端无帽子结构，3’端无聚腺苷酸，并且能够形成部分双链区域，还可直接进行翻译，转录与翻译是互相偶联的。

5. 装配与释放（assembly and release）在宿主细胞内，有一个前体池，合成的蛋白质等累积在前体池，等达到一定浓度以后，就会以一定方式形成有感染性的病毒粒子的生物学过程称为病毒的装配。形成的有感染性的病毒粒子通过一定方式离开宿主细胞称为病毒的释放。

释放：裂解、出芽。绝大多数无包膜病毒释放时被感染的细胞崩解，释放出病毒颗粒，宿主细胞膜破坏，细胞迅即死亡。绝大多数有包膜病毒通过细胞内的内质网、空泡，或包上细胞核膜或细胞膜以出芽方式释放而成为成熟病毒，在一段时间内逐个释出，对细胞膜破坏轻，宿主细胞死亡慢。从单个病毒吸附开始至所有病毒释放，此过程称为感染周期或复制周期。一个感染细胞一般释放的病毒数约为100-1000。

非增殖性感染：病毒感染宿主细胞以后不能产生有感染 性的病毒粒子就叫非增殖性感染。原因可能是病毒基因组侵入细胞后任一阶段出现差错，宿主的DNA蛋白等仍能合成，可能是装配和释放过程出现错误，从而导致非增殖性感染出现。 整合感染：病毒的基因组整合在宿主细胞染色体上，这种感染方式也不产生有感染性的病毒粒子，但与上面所说的那些不同，因为它们的基因组没有整合到宿主染色体上。

1. 非增殖性感染原因有两大类：

a.源于细胞本身产生→非允许细胞 （病毒无法完成感染）

b.源于病毒本身产生→缺损病毒造成

缺损病毒的5种形式：

① 干扰缺损病毒（DI病毒）

② 整合的病毒基因组

③ 卫星病毒

④ 条件缺损病毒

⑤ 假病毒体

DI病毒的特点：①基因组是存在缺失的，不同的DI病毒缺损的大小数量是不同的，有的达到90%，但无论缺损多少，都必需保留有：a.为病毒复制起始化的序列；b.病毒壳体化序列。 ②可以干扰同源的标准病毒的复制，DI病毒和标准病毒为了复制竞争相同的基因功能产物而发生选择性的复制过程，且这种情况下，DI病毒一般处于优势，因为DI病毒含有较小的基因组，对核酸酶的亲和力较大，从而使标准病毒复制数量大大降低。③必须依赖同源病毒才能进行复制。④具有与标准病毒相同的形态特征，结构蛋白与抗原性。

卫星病毒特征是具有极端寄生性，寄生于与之无关的辅助病毒上，基因产物的病毒与DI颗粒有相似性：它也是缺损病毒，必须依赖于辅助病毒才能进行复制，并且能够干扰辅助病毒的复制；但与DI颗粒也有不同：卫星病毒并不是来源于辅助病毒的亚基因组突变体，它是在自然界中存在的一类病毒，于辅助病毒的DNA/RNA毫无关系。

在病毒感染过程中，由于宿主细胞核酸完全取代了病毒基因组核酸的一类病毒，则称为假病毒体。

条件缺损病毒 ：一类基因组发生突变的条件致死突变体，在一定条件下可以增

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殖，在另一条件下导致病毒的死亡。处于流产感染状态的病毒，可以通过一定办法，使它们完成增殖性感染，从而产生子代病毒粒子。

①协同培养：2种或2种以上的细胞来混合培养，假如其中一种细胞是另一种细胞中的病毒允许细胞则混合培养可使病毒增殖。

②协同感染：由2种或2种以上的病毒同时感染一个细胞，因为其中辅助病毒可为流产感染病毒提供繁殖所必需的基因产物。

第六章 病毒的遗传与变异

一、病毒的突变

指基因组中核酸碱基顺序上的化学变化，可以是一个核苷酸的改变，也可为上百上千个核苷酸的缺失或易位。

野生型病毒株（wild type）：通常是实验室适应的，并且与突变体进行比较和选择的病毒株，本身也含有某个性状的突变。这种野生型要与从自然界的宿主种直接分离到的野外分离株分开来，这个代表真正的野生型菌株，叫野外分离株。 （病毒）株（strain）：同一病毒不同的野生型。

型（type）：利用感染型的中和作用所确定的具有不同的血清型的病毒株。 突变体（mutant）：有明确的突变，表型不同于野生型的病毒株 。

变异株（variant）：变异株是表型不同于野生型，而变异原因不清楚的病毒株。

二、自发突变和诱发突变

1. 自发突变：在无任何已知诱变剂的条件下所产生的突变。

DNA病毒和RNA病毒的自发突变有明显区别：DNA：有一整套完整的DNA复制、核对、修正系统RNA：不能自动修复。突变效率：DNA 10-8～10-9、RNA 10-3 ～ 10-4。

2. 诱发突变：在各种理化因子存在的条件下提高突变力的措施。人们根据诱发突变的本质和途径，分为：

① 体外诱变剂 主要是通过一些化学物质时化学物质对核酸的化学作用→核酸的变异→碱基的置换（a.转换 b.颠换）

② 体内诱变剂：

a.碱基类似物：通过互变异构效应来完成碱基置换（烯醇式——酮式）

b.嵌入体：吖啶类染料插入到核酸分子之间，导致核酸移码互变。这2种物质所引起的核酸的变异，都需要病毒细胞处于代谢活性状态，此时核酸处于复制阶段，对处于静止状态的病毒，这2种物质无作用。

紫外线对生物体的损害主要是形成嘧啶二聚体：链间形成的嘧啶二聚体能破坏双链的拆分 、链内形成的嘧啶二聚体导致碱基配对的错误

三、病毒突变体的类型

根据同源突变的核酸：

① 沉默突变：同意突变

② 误意突变：错义突变

③ 无意突变：无义突变

④ 移框突变

⑤ 缺失突变

根据突变的表型：

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① 噬斑突变

② 条件致死突变

③ 抗原性突变

④ 宿主范围突变。

突变株与原先的野生型病毒 (Wild-type virus)特性不同，表现为病毒毒力、抗原组成、温度和宿主范围等方面的改变。

1．毒力改变: 有强毒株及弱毒株，后者可制成弱毒活病毒疫苗，如脊液灰质炎疫苗、麻疹疫苗等。

2．条件致死突变株 ：指病毒突变后在特定条件下能生长，而在原来条件下不能繁殖而被致死。其中最主要是的是温度敏感条件致死突变株（Temperature-sensitive conditional lethalmutant），简称温度敏感突变株(ts株)，在特定温度（28～35℃）下孵育则能增殖，在非特定温度（37～40℃）下孵育则不能繁殖，而野生型在两种温度均能增殖。

3.宿主范围突变株：病毒基因组改变影响了对宿主细胞的感染范围，可感染野生型病毒不能感染的细胞。宿主适应性突株： 例如狂犬病毒突变株适应在兔脑内增殖，由“街毒”变为“固定毒”，可制成狂犬病疫苗。

如何保持病毒遗传形状的稳定： ① 采用分离纯的病毒克隆：挑取单个噬菌斑获得较纯的病毒粒子 ② 将已纯化的病毒粒子保存在严格的条件下 ③ 尽量地减少传代的次数

四、病毒的基因重组

当二种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于亲代的可遗传的子代，称为基因重组（Genetic recombination）。 分子内重组：通常指发生在单一基因组内的DNA或RNA病毒中。需要核酸分子的断裂与其他核酸分子的再连接。

拷贝选择重组：发生在部分具有单一分子基因组RNA病毒中，不涉及核酸分子的共价键断裂，RNA聚合酶选择性地连接到静止模板链上进行了RNA子代链的合成。 基因重配：具分段基因组的RNA病毒中。在重组过程中，它没有核酸分子共价键的破坏，而是具有分段基因组病毒间的核酸片段交换，基因组各片段在子代病毒中随机分配。

动物病毒的基因重组特征：具分段的基因组RNA病毒：在不同毒株之间的混合感染的时候，重组的频率非常高，有点甚至达到50%。具单组分基因组的病毒：大分子物质积聚在前体池中，一定浓度下进行装配，过程中往往是随即分配，因此对一些单组分的基因组（分子较短）来说，重组频率比较低，多组分的频率比较高。逆转录病毒：是一种非常特殊的病毒，其它病毒都是单倍体，只有它是二倍体，所以在病毒混合感染中，重组频率比较高。

植物病毒的基因重组 植物病毒混合感染：除具有分段基因组的植物病毒与上述感染特征相似外，其它的植物病毒表现出不同的特征：①感染过程中存在相互干扰现象。②突变与重组难以区分：由于植物病毒一般来说都是很少基因重组，频率低，很难判断。

1．活病毒间的重组 ：例如流感病毒两个亚型之间可基因重组，产生新的杂交株，即具有一个亲代的血凝素和另一亲代的神经氨酸酶。这在探索自然病毒变异原理

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中具有重要意义。流感每隔十年左右引起一次世界性大流行，可能是由于人的流感病毒与某些动物（鸡、马、猪）的流感病毒间发生基因重组所致。

2．灭活病毒间的重组 ：例如用紫外线灭活的两株同种病毒，若一同培养后，常可使灭活的病毒复活，产生出感染性病毒体，此称为多重复活（Multiplicity reactivation），这是因为两种病毒核酸上受损害的基因部位不同，由于重组相互弥补而得到复活。因此现今不用紫外线灭活病毒制造疫苗，以防病毒复活危险。

3．死活病毒间的重组 ：例如将能在鸡胚中生长良好的甲型流感病毒（A0或A1亚型）疫苗株经紫外线灭活后，再加亚洲甲型（A2亚型）活流感病毒一同培养，产生出具有前者特点的A2亚型流感病毒，可供制作疫苗，此称为交叉复活。

五、基因产物的相互作用

1．表型混合(Phenotype mixing) ：两种病毒混合感染后，一个病毒的基因组偶而装入另一病毒的衣壳内，或装入两个病毒成分构成的衣壳内，发生表型混合。这种混合是不稳定的，传代后可恢复其原来的特性。

2．基因型混合(Genotype mixing) ：指两种病毒的核酸偶而混合装在同一病毒衣壳内，或两种病毒的核衣壳偶尔包在一个囊膜内，但它们的核酸都未重组合，所以没有遗传性。

病毒基因组的构建方法

一、遗传学方法

重组作图

原理：当两株带有不同标记的病毒突变体感染同一细胞培养物时，其标记基因的位置越接近，突变体经过交换产生的病毒重组体频率越低。

单一分子病毒基因组：重组通过断裂与重接机制或拷贝选择机制进行，两个突变体间的重组频率与其在基因组上的物理距离呈递级关系。依据重组频率大小排列可以对各突变体标记基因在染色体上进行精确定位。

分段基因组病毒：重组频率是一种有、无类型。

ts是在重组分析中最常用的突变体。

中间型杂交（血清型或株系）以表型变化、核酸的电泳迁移率等作为遗传学标记，可对分段基因组病毒进行基因作图。病毒蛋白电泳迁移率作为遗传标记，确定特定蛋白的基因定位与作图。中间型多因子杂交在研究DNA病毒病理发生遗传学中发挥作用。

二、分子生物学方法

1. 序列分析：提供信息：ORF；利用生物信息学，分析蛋白功能；确定基因表达的短序列基元（启动子、转录起点、终止子、mRNA切割位点，翻译起始位点等）

2. 转录图与多肽图。转录图：cDNA图。 多肽图：蛋白质组图。

3．互补 (Complementation) ：指两种病毒通过其产生的蛋白质产物（如酶、衣壳或囊膜）相补充，例如辅助病毒与缺损病毒间、两个缺损病毒间、活病毒与死病毒间都可以互补，互补后仍产生原来病毒的子代。

4．增强(Enhancement) ：指两种病毒混合培养时，一种病毒能促进、增强另一种病毒的产量，可能是因为前者压制了产生干扰素所致。

六、病毒变异的实际意义

1．研制减毒活疫苗：如ts株、宿主适应性突变株的研制。

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2．应用于基因工程：目前病毒基因工程正沿着二个方向发展：一是将编码病毒表面抗原的基因移植到质粒中去，在大肠杆菌中产生大量表面抗原物质，以制备疫苗或诊断用抗原。如乙型肺炎病毒编码表面抗原的DNA片段已在酵母菌中表达，该疫苗正进行人体观察；二是探索病毒作为基因工程载体的可能性，以便将所需要的外源基因带入人体或动物体内，以治疗人类遗传疾病或创造动物新品种的目的。

第七章 病毒的起源与进化

团聚体小滴性质：直径 1 ?m – 500 ?m；稳定存在几小时至几周；外周增厚呈膜状结构，与周围水液有明显界限；具原始代谢特征；可以增长和繁殖。

微球体性质:1 ?m－2 ?m（相当于细菌大小）；可吸纳周围环境的脂类，并形成膜状结构；膜表现选择透性，反映渗透压变化；吸纳周围环境中蛋白质分子，微球体可“增长”和“繁殖”。

“RNA 世界”假说：最原始的细胞是由一身兼有酶和繁殖二任的原始RNA 主宰的;以后经过氨酰反应合成了蛋白质,进化为以“RNA -蛋白质”为基础的细胞. 最后,再经过核苷酸的脱氧,进化为现代的“DNA - RNA - 蛋白质”为基础的细胞.难以解决的、根本性的问题：例如，RNA 在没有相应的酶系统作用下，在水溶液中是难以聚合，原始的RNA 从何而来呢? 至于复制问题,人们虽可在非酶促条件下,令核苷酸分子在人工合成的RNA 模板上聚合. 然而在形成一段寡核苷酸短链后,便停了下来,聚合点无法向前移动. 那么,在没有酶催化的情下,RNA 链能否完全复制呢?

RNA world ：1，核酶具有催化功能，能主导反应；2，RNA带有遗传信息，可自主复制；3，许多辅酶和能量分子都带有RNA分子。

三、病毒的起源

1）退化性起源学说

2）生物大分子→细胞→病毒学说

3）生物大分子到病毒学说

四、病毒的进化

1. 研究病毒进化的复杂性

(1) 病毒特别小,无法用常规的进化生物学方法研究病毒进化;

(2) 病毒不像其他生物有“化石”或“遗体”可供进化研究之用;

(3) 病毒的进化有一定的随机性,每一步演变都有一定的概率。很难从病毒的现状或短暂时间内病毒演变的情况,来推论出病毒演变的过去和未来。

2. 病毒进化的基础 变异是病毒进化的基础

a、突变 突变主要是指单个碱基的替换、插入或缺失。不同病毒的变异频率差异很大。变异性差异反映了寄主范围的差异。微观进化(microevolution) ,是病毒“准种”形成的原因。

b、重组 重组是复制时不同遗传变株的核苷酸链间交换遗传信息片段的过程,可分为同源重组和非同源重组。重组是宏观进化(macroevolution) ,病毒通过重组可以获得新的基因,增加对寄主的适合度,使有益性状得以产生和传播,使有害性状得以清除。

c、重排 有些植物RNA 病毒的基因组是分离的,这些病毒的RNA 片段可以进行种

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间交流,即重排(reassortment)也称假重组(pseudorecombination)。重排也是造成变异的一种机制。基因重复(gene duplication) 也是病毒进化的一种推动力。

3．细胞基因、转基因等对病毒进化的影响

a、病毒基因与细胞基因的重组 病毒和其寄主中表达的一些基因可能发生许多重组,进而产生毒性更强的新变株(种) 。

b、病毒基因与转基因的重组 转基因与缺陷型病毒间可以重组,而且重组恢复很容易检测到。

c、入侵病毒对病毒进化的影响 如果植物在自然条件下受两种或多种病毒的侵染,可能会产生新的病毒。异源重组一般不亲和,即使亲和其功能也不全,在竞争中处于劣势,因而多不能存活。寄主转基因与病毒重组出现毒力更强病毒的可能性更小。

4. 病毒进化的基本特征

(1) 新病毒不断产生,而且基本上是从另一种宿主的病毒演化而来。

(2) 新病毒产生后,在新的宿主以较快的速度进行变异。

(3) 新病毒稳定后,病毒的毒力大多处在中等水平上。

(4) 病毒的进化既有一定的随机性,又受到一定的选择压力而呈现一定的方向性和稳定性。

(5) 病毒的各个基因以及基因的各个部分,在进化上具有不同的进化特征。

5. 病毒进化的根本目的是增加病毒的多样性。

6、病毒进化的研究方法

病毒基因组特别小,进化快,受干扰因素少, 是一种研究进化问题的很好材料。 研究病毒的进化有多种方法，可以通过序列同源性、基因组排列顺序、基因组的基因组成等方面构建病毒的进化树。

一组相关病毒的进化史称为种系发生,通常以分叉的进化树表示,两个枝端的毒株在其起点处有着共同的祖先。毒株的亲缘关系的远近以树枝的长短表示。 进化树的推导受多种因素的影响。一方面由于快速测序技术的发展, 毒株序列数据积累很多, 样本越多它们之间种系关系中可能的排列组合方式呈指数增加, 从中可能推导出的树的种类就越多, 这就给分析工作增加了难度。另一方面, 毒株的样本收集不全也会使得出的进化树与真实的情况有差异。

第八章 病毒与肿瘤 2007

一、肿瘤的概念

肿瘤是机体在各种致瘤因素的作用下，局部组织细胞基因发生改变导致克隆性增生而形成的新生物，通常形成肿块。

（一）肿瘤的增生

1 呈持续性、自主性生长，与机体不协调，原因去除仍能继续生长。

2 具有不成熟性，在不同程度上失去了分化成熟的能力。

3 有害无益。

（二）生理、炎症和损伤的增生

1 都为机体生存所需要的增生，与机体协调，受机体控制，原因去除增生停止。2 都具有成熟性。

3 多数对机体有利

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三、肿瘤发病机理

遗传因素

（一）、体细胞突变

正常细胞-突变—癌前细胞-促癌因素——肿瘤

1、肿瘤的单克隆起源学说：特异标记染色体；相同同工酶

2、两次突变说：视网膜母细胞瘤

3、基因外调节学说：蛋白质、RNA、生物膜改变；基因修饰；

（二）、癌基因

1、种族差异

2、家族聚集

3、遗传性肿瘤

4、遗传缺陷、染色体畸变与肿瘤

环境因素——致癌因子

物理致癌因子：很多能产生辐射的物质，电离辐射、X射线、紫外线、太阳光 化学致癌因子：砷、煤焦油及其衍生物、苯、某些烃类、苯胺（一种用于染色的物质）、石棉等。

生物因素——病毒致癌因子。

四、肿瘤发生机制的学说

1、单克隆起源学说（或者体细胞突变）

肿瘤细胞群体来自单一细胞的克隆。

学说的证实：

(1)女性葡萄糖－6－磷酸脱氢酶(G6PD)基因在肿瘤中表现出均失活或均不失活。

(2)同一肿瘤所有细胞具有相同的标记染色体。

2、二次突变论学说：细胞必须发生两次突变才能形成肿瘤。遗传性肿瘤的第一次突变发生在生殖细胞内，并遗传给后代，后代体细胞又一次发生突变，使细胞转化。

学说的证实：

遗传性视网膜母细胞瘤：双侧，早发，家族性。

散发性视网膜母细胞瘤：单侧，晚发，散发性。

“二次突变”假说的意义

一，为解决遗传性和体细胞突变通过何种机制在肿瘤发生过程中起作用提供了思路。

二，肿瘤细胞发生过程中隐性遗传性决定因素与体细胞表型连接起来。

3、多步骤遗传损伤学说：

细胞癌变需要多个肿瘤相关基因的协同作用，须经过多阶段的演变，这些基因的激活/失活在时间上有先后顺序，在空间位置上有一定配合。

肿瘤的起始阶段——原癌基因激活（逆转录病毒的插入和原癌基因的点突变）。肿瘤的演进阶段——染色体重排、基因重组、基因扩增。

癌基因(oncogene,onc)能够使细胞癌变的基因统称为癌基因。癌基因是正常细胞

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中的基因，是细胞的必须基因癌基因已被证实是正常存在于生物(包括人类)基因

组内的,它的结构异常或表达异常,也的确可以引起细胞癌变.控制细胞生长的基

因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性。

（一）病毒癌基因

逆转录病毒中，能够引发肿瘤的基因片段。这个片段来源于宿主基因组而非原病

毒基因组，宿主RNA逆转录后插入病毒中，作为病毒的一部分。此插入片段的编

码蛋白是肿瘤的强诱导剂。 致瘤病毒中存在的某些核苷酸序列称为癌基因,即病毒癌基因(v-onc)。将逆转录病毒上所含的致癌基因称为v-onc,而将宿主细胞基

因组中的同源基因称为原癌基因或细胞癌基因。

(二) 细胞癌基因是指真核细胞中存在的一段核苷酸序列,这段核苷酸序列在正

常细胞中以非激活形式存在,故又称原癌基因(proto-onc).在某些特定条件下激

活可致癌变。对应宿主细胞的基因片段称为原癌基因。可促进正常细胞生长、增

殖、分化、发育等。原癌基因具有内含子和外显子。

v-onc 与c-onc的不同：V-onc无内含子，癌基因常常比原癌基因呈更高水平的

表达。外显子有微小差别：癌基因编码的蛋白质在结构和功能上不同于由原癌基

因编码的蛋白质。V-onc常出现碱基取代或缺失等突变

(三) 原癌基因分类

1.生长因子(growth factor, GF)及其类似物,以及生长因子受体(GF--R)

2.酪氨酸蛋白激酶:某些酶蛋白磷酸化(ser)

3.GTP结合蛋白:影响细胞内的信号系统

4.核内蛋白质: 结合DNA发挥转录调控作用,甚至影响复制

(四) 癌基因的激活

1.调节序列的插入 启动子 ,增强子

2.基因突变

3.基因重排 染色体异位

4.基因扩增 原癌基因复制多个拷贝

5.基因偶联 某些原癌基因在特定条件下因其它原癌基因首先激活而活化

抑癌基因(tumor suppresser gene)能够抑制肿瘤发生的基因

最有名气的肿瘤抑制基因是P53基因，与50%的肿瘤发生相关。P53基因定位于

17p13.1，含11个外显子，编码53kD蛋白，393个氨基酸。

P53基因的4个功能区：

1）N-端调控活性区—行使功能的区域，既介导蛋白质相互作用的区域，由73

个氨基酸构成。

2）序列特异性结合区—核心区，具有特异性DNA结合功能，此区域含有大量的

突变热点。

3）寡聚区—介导P53蛋白自身形成4聚体。

4）C-端DNA非特异性结合区。

野生型p53基因称为抑癌基因，正常p53的生物功能好似“分子警察” : G1

期检查DNA损伤点,监视细胞基因组的完整性.如有损伤,P53蛋白阻止DNA复制,

以提供足够的时间让损伤DNA修复.如果修复失败,P53蛋白则引发细胞程序性死

亡,阻止具有基因损伤,可能诱发癌变的细胞产生.

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P53为核内磷酸化蛋白，作为转录因子调控其他蛋白的活性达到细胞周期和细胞凋亡的控制。P53蛋白的失活导致细胞保护功能的丧失而导致细胞周期的紊乱。

病毒导致肿瘤细胞产生的原因：1增加细胞突变的机会2病毒携带的致癌基因整合于宿主细胞基因组3某些病毒（如HBV)的蛋白质抑制抑癌基因的表达.

DNA肿瘤病毒引起细胞转化的机理：DNA肿瘤病毒感染细胞后，其基因组整合到细胞DNA链，编码产生特异的病毒性转化蛋白并引起和维持转化表型的机理。病毒DNA随机整合到细胞染色体DNA中后，在细胞RNA多聚酶Ⅱ的作用下转录成V-mRNA，运送到胞质的多核糖体，翻译为转化蛋白(如T抗原)。

1.内源性病毒（endogenous virus）

这是指RNA肿瘤病毒感染机体后，其遗传信息整合到宿主细胞核的DNA中，并作为正常细胞的一部分通过性细胞由亲代垂直递给子代的病毒。内源性的特点：①RNA肿瘤病毒的DNA拷贝与细胞DNA共价结合，可在宿主的性细胞及全部体细胞中存在；②内源性病毒基因组通过遗传由亲代传给子代；③结合的内源性病毒基因组受到宿主遗传因素的控制；④内源性病毒可由于自发的或外界因素所激活而增殖。这种病毒一般含有gag、pol、env等复制基因，可编码相应的产物而形成病毒颗粒，所以是非缺失性病毒。在一般情况下，由于宿主细胞节制性控制而处于静止状态，内源性病毒并不表达或复制病毒颗粒。

2. 外源性病毒（exogenousvirus）

这类病毒与动物和人类的白血病、淋巴瘤以及肉瘤的发生密切有关，表现为供体从外界环境水平式感染。

20xx年10月，我国批准了世界上首个商品化的基因治疗药物，P53——腺病毒注射液用于治疗头颈部肿瘤。

肿瘤免疫治疗更具有应用价值：1通过相关的技术方法调动宿主免疫系统的抗肿瘤免疫应答能力，消灭已经形成的肿瘤细胞或抑制其进一步发展。2肿瘤免疫治疗的关键是克服宿主对肿瘤细胞的免疫忽视状态。

嗜肝DNA病毒科包括人HBV、土拨鼠HBV、鸭HBV等

1成熟病毒颗粒为42nm的球形颗粒。2脂蛋白外膜（HBsAg）。3核心为核壳蛋白包裹的DNA分子,核壳蛋白即为核心抗原(HBcAg)和e抗原（HBeAg）。4核心内有病毒DNA和具有逆转录酶活性的DNA多聚酶。

乙肝病毒携带者外周血中有3种形态颗粒：

1小球形颗粒(22nm）；

2管形颗粒 (22×50—500nm)；

3完整的病毒颗粒，又称为Dane氏颗粒(42nm)。

三种颗粒中以小球形颗粒为多。

HBV的基因组为非闭合的双股环状DNA（不完全双链）。有4个开放读码框架：S区：编码HBsAg；C区：编码HBcAg和HBeAg；X区：编码HBxAg，并与肝细胞癌变有关 ；P区：编码DNA多聚酶，逆转录酶。其中前C区和前S区的基因容易发生变异。注射乙肝疫苗后产生的抗-HBs无免疫保护作用，结果HBsAg与抗-HBs

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可同时出现于血清中。

乙肝表面抗原（HBsAg）的组成形式

小蛋白（S蛋白）：226个氨基酸组成，含HBV的主要中和抗原。中蛋白（M蛋白）：由S蛋白和Pre-S2蛋白（55个氨基酸）组成，含中和抗原和多聚白蛋白受体。 大蛋白（L蛋白）：由M蛋白和Pre-S1蛋白（108—119个氨基酸）组成，含有肝细胞受体。

乙肝病毒抗原的功能

HBsAg：是机体感染HBV后最先出现的血清学指标，能使机体产生中和抗体，PreS蛋白含中和决定簇，并有细胞免疫功能。表面抗原HBsAg存在于三型颗粒中；是HBV感染的主要标志；分亚型（a, d/y, w/r, adr）；产生抗-HBs；Pre S1、Pre S2及抗- Pre S1和抗- Pre S2。

HBcAg：有很强的免疫原性，能诱生相应抗体，但不是中和抗体；难以在血液中查到。核心抗原HBcAg仅存在于Dane颗粒中；不易在血液中检出；可在感染的肝细胞表面存在；刺激机体产生抗HBc（IgG、IgM）；表明病毒在复制。

HBeAg：是HBV活动复制和有传染性的重要标记，能诱生相应抗体但不能中和HBV。仅存在于Dane颗粒中；游离存在于血液中；为病毒复制及强传染性的指标；产生抗－HBe，是预后良好的征象。

HBxAg：是一个具有广泛活性的反式调节因子，可能与肝细胞癌有关。

人群中流行病学研究显示，HBxAg携带者较无HBV感染者发生肝细胞癌的危险性高217倍。可能由于HBV 的HBx Ag的是致癌的启动因子。

HBV感染与原发性肝癌的发生有密切关系，其依据是：①经流行病学调查表明，乙型肝炎患者及HBsAg携带者的原发性肝癌发生率明显高于未感染人群（危险性高217倍）；②用与HBV分子生物学相似的土拨鼠肝炎病毒 (WHV) 可诱发土拨鼠原发性肝癌。而未感染鼠则无一只发生肝癌；③用HBVDNA探针与肝癌组织进行Southern 印迹核酸杂交时，获得阳性结果，说明肝癌细胞染色体上整合有HBVDNA。

肝癌预防 注射乙肝疫苗，其目的是促使机体产生HBsAb。

乙型肝炎的免疫预防，采取切断传播途径为主的综合性措施：对乙肝患者及携带者的血液、分泌物和用具等要严格消毒灭菌；严格筛选献血员，防止血液传播；提倡使用一次性注射器及输液器；凡手术操作，使用接触过血液的医疗器械等也必须严格消毒，要防止病人与医务人员间的相互传播；对高危人群要进行特异性预防。

主动免疫 接种乙型肝炎疫苗是最有效的预防措施。乙型肝炎疫苗是纯化的HBsAg，不含HBV DNA，具有良好免疫原性，而无感染性。应用的疫苗有两种，即HBsAg血源疫苗和HBV基因重组疫苗。另有HBsAg多肽疫苗或HBV DNA疫苗均在研究之中。

被动免疫 乙肝免疫球蛋白（HBIg）是由含有高效价抗HBs人血清提纯而成，可用于紧急预防。主要用于以下情况：①医务人员或皮肤损伤被乙型肝炎患者血液

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污染伤口者；②母亲为HBsAg、HBeAg阳性的新生儿；③发现误用HBsAg阳性的血液或血制品者；④HBsAg、HBeAg阳性者的性伴侣。

人类免疫缺陷病毒

艾滋病即获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(HIV)所致的一种传染病。HIV的靶细胞为CD4细胞(Th细胞)，由于此细胞的受损，导致机体免疫功能破坏，由此而产生一系列机会性感染和恶性肿瘤，或其他威胁生命的表现。 获得性---艾滋病并非先天具有，而是后天获得。

免疫缺陷---AIDS的发病机理在于，HIV通过造成人体免疫系统的损伤，进而导致免疫系统防护功能的减低甚至丧失。

综合症---在临床症状方面，由于免疫缺陷导致的各个系统的机会性感染、肿瘤而出现复杂的伴随症状群。

HIV属于逆转录病毒(retrovirus)科，慢病毒(lentivirus)亚科。HIV分两型，即HIVl型及HIV2型，分别发现于19xx年和19xx年。世界范围内的流行主要由HIVl型所致，HIV2型仅在西非如象牙海岸、几内亚等国家呈地方性流行。 逆转录病毒的共同特性：

1.病毒为球形，有包膜，表面有刺突(与病毒的吸附和穿入有关)。

2.基因组为单正链RNA双体结构。

3.病毒体含逆转录酶。

4.具有gag、pol、env三个结构基因。

5.病毒增殖的突出特点是在复制病毒RNA时要通过DNA复制中间型 (DNA replicative intermediate)。并与宿主细胞的染色体整合。

HIV基因组结构

1.HIV的基因组为RNA双分子，其单链长约9.2kb.

2.两相同的正链RNA与逆转录酶，整合酶，核糖核酸酶，P6，P7等蛋白结合。

HIV1型基因可分为3类，即结构、调节及附加基因。

1)结构基因含gag(群抗原基因)、pol(聚合酶基因)、env(包膜基因)等，编码病毒的基本结构成分。

gag：编码5.5×104的多聚蛋白。前体N端附有十四烷基化合物，后者与N端分解产物p17有关。p17位于病毒包膜内表面，在确定病毒核心在细胞的发芽位置时起重要作用。另一个裂解产物是p24，构成病毒核心的主要结构壳蛋白，大量存在于病毒颗粒中。p9及p7也是gag多聚蛋白较小的核心蛋白产物，由一中间体p15迅速裂解而来。

pol：基因产物与各种酶的功能相关，如逆转录酶、RNA酶H、整合酶或核酸内切酶等。逆转录酶及相关的RNA酶H与第l条前病毒DNA链有关。在DNA前病毒形成后，整合酶或核酶内切酶将此前病毒整合人细胞DNA内，两者均有相当高的免疫原性。

env：编码一种多聚蛋白gp160，随后裂解为外膜糖蛋白：gp120及gp41(后者因其功能又称为透膜蛋白)。gp120与细胞CD4分子具有很强的亲和力。gp120及gp41分子均具有高度免疫原性，在血清学诊断中极为重要。它们位于病毒颗粒及感染细胞的最外部，因此，成为主要抗原，也可能为有效的疫苗片段。

2)调节基因有3个：tat、rev及nef，参与病毒复制的调节。

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① tat：缺乏tat基因功能的HIV不能复制。tat蛋白(p14)保持病毒mRNA的稳定性，在感染细胞核中的聚集量依病毒复制的速度而定。②rev：能产生大量病毒结构蛋白所需的信息，增加gag与env的表达，是病毒复制的基础。

③nef：为负性转录调节因子，能抑制所有HIV基因表达。其产物是p27，HIV感染者中有一半产生nef蛋白抗体。

3)附加基因存在于HIV l型及2型中，不是HIV复制所必需。

①vif：作用尚不明。编码2.3×106蛋白，当细胞一细胞接触产生感染及复制时，vif蛋白可干扰游离病毒感染性的作用。

②vpr：编码一大约为1.2×106的蛋白，存在于病毒颗粒及感染细胞内。大约一半HIV感染者产生针对此蛋白的抗体。

③vpu：产生一1.6×106产物，与病毒细胞膜出芽位点有关。出现vpu蛋白抗体是产生HIVl型感染的证据，在HIV2型感染者则不出现。相反，vpx基因不存在于HIVl型，vpx编码p14蛋白，具有较弱的免疫原性，其抗体的出现可以肯定是HIV2型而不是HIVl型感染。

HIV的生活史

1.HIV病毒颗粒的p120外壳蛋白可以识别并与细胞表面受体CD4结合;

2.病毒自身携带逆转录酶，它以病毒RNA为模板合成DNA.

3.DNA合成后，病毒的核心发生解体，以新合成的DNA为模板，形成双连DNA，然后整合到宿主染色体中；

4.病毒利用宿主细胞中的转录系统转录出病毒RNA，并以其为模板合成病毒蛋白质；

5.积累大量的病毒RNA和蛋白质时，组装病毒颗粒，并通过出芽生殖释放出体外。 培养特性

? HIV感染宿主范围狭窄。恒河猴和黑猩猩可作为动物模型。

? HIV仅感染膜表面有CD4分子的细胞。

? 实验室常用人T淋巴细胞传代适应株（H9）分离培养HIV。

HIV病毒致病原理

1．HIV病毒一旦进入细胞，可以在细胞内大量增殖，导致感染细胞破裂

2．辅助T细胞最易受HIV病毒侵染。

3．HIV病毒除了有直接杀伤力外，还有间接杀伤力。

4．HIV病毒的外壳蛋白gp120和gp41易从病毒颗粒上脱落。免疫系统对健康的T4淋巴细胞进行攻击。

5．脱离了HIV病毒的 gp120和gp41复合体与T4淋巴细胞的CD4结合后，会阻碍T4淋巴细胞的分裂。

6．HIV病毒感染细胞后可能诱发全部T细胞产生编程性细胞死亡。

HIV感染后的发病机理可归纳如下：

1、HIV侵入人体后首先与细胞表面含有CD4受体CD4+T淋巴细胞结合，进入细胞进行复制，部分整合于细胞染色体DNA中成为潜伏型；

2、机体细胞免疫和体液免疫对HIV的抵抗作用，使感染初期的HIV低水平复制；

3、在其他因素的作用下，潜伏的HIV被激活而大量复制，广泛侵入CD4+T淋巴细胞， 使CD4+T淋巴细胞、单核 — 巨噬细胞、B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和NK细胞等功能受损，最后导致整个免疫功能缺陷，最终发生一系列顽固性机会

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感染和肿瘤的发生。

HIV感染与肿瘤

在HIV感染者中卡波济肉瘤，B细胞淋巴瘤，何杰金病以及某些肿瘤发生率升高，和机体免疫功能破坏直接相关，但可能不是唯一的原因。当HIV感染者出现B细胞淋巴瘤时与EBV病毒感染有关，HIV并不能直接引起肿瘤，因在肿瘤细胞DNA内并不能证明有病毒序列存在。

HIV感染的诊断方法主要有两类：

1.检验抗体 特异性抗体的产生一般在感染后1~4周内出现，目前主要的实验方法有ELISA，RIA，免疫印迹试验等。

2.测定病毒及其组分：病毒分离；测定病毒抗原；检测病毒核酸

检测抗体

ELISA、IFA、RIA: 敏感性好，应用方便。尤其ELISA法目前最为常用。但由于HIV的全病毒抗原与其他逆转录病毒（HTLV）有交叉反应，而且病毒系芽生释放，病毒包膜中常带有细胞成分，故有一定的假阳性。因此，这类试验仅适用于筛查HIV抗体.

Western Blot（WB）: HIV抗体阳性者进一步用WB法予以确认。

防治原则

① 建立HIV感染和AIDS的监测网络，控制疾病的流行蔓延；

② 进行广泛的宣传教育，取缔娼妓，防止性传播疾病的流行，抵制吸毒等社会

弊病；

③ 检测高危险人群包括供血员、同性恋、静脉注射毒品成瘾者、血友病患者，

国外旅游者和外事使馆人员等；

④ 禁止进口血液制品如凝血因子Ⅷ等；

⑤ 加强国境检疫、留检等。

药物和疗法

常用药物：AZT(叠氮胸苷)、二脱氧肌苷等。

常用疗法：反义疗法、HIV疫苗、鸡尾酒疗法

AIDS的治疗

①阻止HIV吸附穿入的重组可溶性CD4分子(rsCD4)的使用；

②给予抑制病毒逆转录酶活性的核苷类似物如叠氮胸苷(azidothymidine,AZT),双脱氧肌苷(2，,3，-dideoxyinosine,DDI)与2，,3，-双脱氧肌苷(2，,3，- dideoxyinosine,DDC)等；

③非核苷类逆转录酶抑制剂，如德拉维拉丁(Delaviradine)和耐维拉平(Nevirapine)等，国内多用施多宁；

④近年来研制的蛋白酶抑制剂，如佳息患、赛科纳瓦(sapuinavir)、瑞托纳瓦(ritonavir)以及英迪纳瓦(indinavir)等；

⑤免疫调节剂，如IFN-γ，IL-2和胸腺素等。

“鸡尾酒疗法”：联合交替使用2种HIV逆转录酶抑制剂和1种HIV蛋白酶抑制剂，可有效地把血液中的HIV含量减少到最低(外周血中测不出HIV或其RNA)，因而能减轻症状及延缓生命。但无法清除整合在CD4+细胞染色体上的前病毒，

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因此仍不能从体内彻底清除HIV。

第九章 人类及动物病毒 2007

一 病毒感染及病毒性疾病

病毒感染：病毒侵入体内并在靶器官细胞中增殖，与机体发生相互作用的过程为病毒感染(viral infection)。

病毒性疾病：感染后常因病毒种类、宿主状态不同而发生轻重不一的具有临床表现的疾病，称为病毒性疾病(viral disease)。

二、病毒在机体内的散播

局部散播:病毒只在入侵部位感染细胞局部散播。

血行散播：病毒可在入侵局部增殖进入血液经血流或神经系统向全身或远离入侵部位的器官散播。

神经散播：HSV、VZV、狂犬病病毒。

三 病毒感染的条件

病毒感染性(致病性、毒力、病毒量).

感染途径.

宿主易感性(病毒受体、机体免疫状态、其他)

四 病毒感染的类型

1.按有无临床症状，可分为隐性感染和显性感染。

2.依病毒感染后在机体内滞留的时间长短，分为急性感染和持续性感染。

3.持续性感染根据发展和预后又分为慢性感染、潜伏感染、慢发病毒感染和急性感染的迟发并发症。

隐性病毒感染:病毒进入机体后不引起临床症状的感染，对组织和细胞的损伤不明显。相关因素：病毒毒力弱、机体防御能力强、病毒种类、病毒的性质。 病毒仍可在体内增殖并向外界播散病毒，可成为重要的传染源。隐性感染者虽不出现临床症状，但仍可获得免疫力而终止感染。

病毒携带者：有部分隐性感染者一直不产生对此种病毒的免疫力叫病毒携带者，无症状，但病毒可在体内增殖并向外界排泄播散，也是重要的传染源。

显性病毒感染

有的病毒如天花病毒、麻疹病毒等进入机体，到达靶细胞后大量增殖，使细胞和组织损伤，机体出现明显的临床症状，这样的感染称为显性病毒感染或临床感染

急性(病原消灭型)病毒感染

病毒侵入机体后，在细胞内增殖，经数日以至数周的潜伏期后突然发病。

在潜伏期内：1、病毒增殖到一定水平，由靶细胞的损伤和死亡而导致组织器官的损伤和功能障碍，出现临床症状。2、宿主动员非特异性和特异性免疫因素清除病毒。

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宿主一般能在症状出现一段时间内，把病毒清除掉而进入恢复期。

特点：为潜伏期短，发病急，病程数日至数周。病后常获得特异性免疫。因此，特异性抗体可作为受过感染的证据。

持续性病毒感染

病毒可在机体内持续存在数月数年数十年。可出现症状，可不出现症状而长期带病毒，成为重要的传染源。

持续性病毒感染有病毒和机体两方面的因素：

1机体免疫功能低下，无力完全清除病毒；

2病毒存在于受保护的部位或病毒发生突变,可以逃避宿主免疫作用；

3某些病毒的抗原性弱，难以产生免疫应答；

4有些病毒在感染过程中产生缺陷性干扰颗粒（DIP），干扰病毒的增殖，因而改变病毒的感染过程，形成持续性感染；

5病毒基因整合在宿主细胞的基因组中，长期与宿主细胞共存。

四种类型：

1.潜伏性病毒感染

经急性或隐性感染后，病毒基因组存在于一定组织或细胞内，但并不能产生有感染性的病毒体。在某些条件下病毒被激活而急性发作，病毒仅在临床出现间歇性急性发作时才被检出。在非发作期，用一般常规法不能分离出病毒。例如：单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV-1）感染;水痘带状疱疹病毒（VZV）感染.

2.慢性病毒感染

经显性或隐性感染后，病毒并未完全清除，可持续存在于血液或组织中并不断排出体外，病程长达数月至数十年。患者可表现轻微或无临床症状。如乙型肝炎病毒（HBV）、巨细胞病毒（CMV）及EB病毒（EBV）等常形成慢性感染。

3.慢发病毒感染(迟发病毒感染)

病毒感染后潜伏期很长可达数月、数年甚至数十年之久。此时机体无症状，也分离不出病毒。一旦发病出现慢性进行性疾病，最终常为致死性感染。如：AIDS、羊瘙痒病（scrapie）、人克雅病（CJD） 、库鲁病（Kuru）等。库鲁病是朊病毒感染机体后，经过长达数十年的潜伏期后，引起的一种进行性小脑退行性疾病。

4.急性病毒感染的迟发并发症

急性感染后1年或数年，发生致死性的病毒病，如亚急性硬化性全脑炎（SSPE）该病是在儿童期感染麻疹病毒后，有些到青春期才表现为中枢神经系统疾病，用电镜在脑组织中可查到类似麻疹病毒样颗粒。这可能是麻疹病毒的缺陷病毒。

五 病毒感染引起宿主细胞的变化

病毒对细胞的致病作用包括来自病毒的直接损伤和机体免疫病理应答两个方面。敏感的宿主细胞被病毒感染后，两者相互作用下可表现为：杀细胞性感染；稳定状态感染；细胞凋亡；包涵体的形成；细胞增殖和转化；病毒基因的整合。

（一）杀细胞性感染

病毒在宿主易感细胞内增殖造成细胞破坏与死亡，这种感染称杀细胞性感染。 病毒在细胞内增殖引起细胞变性、死亡裂解的作用称病毒的细胞病变效应（CPE）。机制：病毒的早期蛋白影响宿主细胞；病毒蛋白的毒性作用；引起细胞内溶酶体膜破裂；细胞膜受体破坏引起细胞免疫病理损伤；对细胞器造成损伤。

(二)稳定状态感染

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一些不具有杀细胞效应的病毒（多为有包膜病毒）所引起的感染称稳定状态感染。病毒在感染宿主细胞的过程中，对细胞代谢、溶酶体膜影响不很大。成熟的病毒多以出芽方式释放出来，其过程缓慢、病变轻微，细胞暂时还不会出现裂解和死亡，但可发生宿主细胞膜受体被破坏、细胞膜成分发生变化，出现细胞融合及细胞表面产生新的抗原等。

1.细胞融合：感染与未感染的细胞融合，可以使病毒从感染的细胞直接进入相邻的正常细胞，有利于病毒在细胞间的扩散。

2.细胞膜出现新抗原：病毒在细胞内增殖过程中，将病毒基因编码的蛋白质插入细胞膜表面，导致细胞膜表面抗原的改变。有利于进行病毒感染的诊断。

（三）细胞凋亡.细胞凋亡（cell apoptosis）是由细胞基因自身指令发生的一种生物学过程。实验研究证实有些病毒（腺病毒、人免疫缺陷病毒等）增殖可直接诱导细胞凋亡，也可通过病毒基因组编码的蛋白质间接作用下诱发细胞凋亡。

（四）包涵体的形成

某些受病毒感染的细胞内，用普通光学显微镜可看到有与正常细胞结构和着色不同的圆形或椭圆形斑块，称为包涵体。因病毒种类不同，包涵体有位于胞浆内的(痘病毒)，也有在细胞核内的(疱疹病毒)；或者两者都有(麻疹病毒)；有嗜酸性的或嗜碱性的。

包涵体的本质：①有些病毒的包涵体就是病毒颗粒的聚集体；②有些是病毒增殖留下的痕迹；③病毒感染引起的细胞反应物。故可作为诊断依据和鉴定病毒的参考。

（五）细胞转化增生和病毒基因组的整合

某些DNA病毒的全部或部分核酸，或RNA病毒基因组经逆转录后产生的DNA，结合至细胞染色体中，称为整合。整合作用可使细胞遗传性状发生改变，即转化（transformation）。转化的细胞生长、分裂失控，细胞可发生恶变。

六 病毒感染细胞的分子机制

1.与细胞膜的相互作用：吸附蛋白；受体蛋白；环境因子

2.与细胞转录的相互作用：抑制细胞转录；提高病毒转录效率：转录活化子、增强子；利用宿主酶加工病毒mRNA

３.与翻译系统的相互作用：抑制宿主翻译；降解宿主mRNA；竞争宿主翻译系统； 改变宿主翻译系统的特异性

４.与细胞DNA复制的相互作用：降解细胞ＤＮＡ、改变正常复制位点、抑制细胞ＤＮＡ合成并为病毒ＤＮＡ提供原料

七、宿主的抗感染

非特异性防御：皮肤、纤毛上皮、低pH环境、发热、体液调节、巨噬细胞、干扰素等。

特异性防御： Antibody (IgG, IgM, IgA)、T细胞

1、非特异性抗病毒免疫

(一)先天不感受性：主要取决于细胞膜上有无病毒受体。

(二)屏障作用

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解剖学屏障：如皮肤粘膜屏障、血脑屏障、胎盘屏障等。

生物化学屏障：存在于正常人或动物血清和体液中的非 特异抑制物，如补体系统中的某些成分能增强对病毒的中和作用。

血脑屏障：能阻挡病毒经血流进入中枢神经系统。可以保护绝大多数脊髓灰质炎患者不发生麻痹。

胎盘屏障

(三)细胞作用

巨噬细胞(Mф)：对阻止病毒感染和促使病毒感染的恢复具有重要作用。

中性粒细胞：虽也能吞噬病毒，但不能将其杀灭，病毒在其中还能增殖，反而将病毒带到全身，引起扩散。

自然杀伤(NK)细胞：能杀伤许多病毒感染的靶细胞。

(四)干扰素。扰素（interferon，IFN）：由病毒或其他IFN诱生剂诱使人或动物细胞产生的一类糖蛋白。它作用于机体细胞可表现出抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多方面的生物活性。干扰素的抗病毒作用无特异性

2、特异性抗病毒免疫

（一）体液免疫的抗病毒作用

受病毒感染后，机体即可产生特异性抗体，按其作用可分为中和性抗体(neutralizing antibodies，NTAb)、补体结合抗体（complement fixation antibodies, CFAb）及血凝抑制抗体（heamagglutination inhibition antibodies, HIAb）等。这些抗体主要是IgG、IgM和IgA。NTAb能消除病毒的感染性，是唯一具有保护作用的抗体。CFAb、HIAb一般没有保护作用，可用于血清学诊断。

中和性抗体的作用机理

中和性抗体是针对病毒表面抗原的抗体。它与病毒表面的抗原决定簇结合，使病毒失去吸附和穿入的能力，但不能直接灭活病毒，更不能对已进入细胞内的病毒发挥作用。中和性抗体的抗病毒作用，主要是预防感染的发生及蔓延。

2．具有抗病毒作用的免疫球蛋白(Ig)

IgG：约占Ig的35％，是主要的NTAb，又是唯一可通过胎盘的Ig。一般生后6个月以内的婴儿，因体内保留有健康母亲通过胎盘传给的各种IgG，这一期间很少患病毒性传染病。

IgM：分子量大，是多聚体Ig，出现于病毒感染或疫苗接种后的早期，有中和作用但不如IgG强。因其出现于机体感染早期，并且消失较快，故检出特异性IgM，可做为在近期已发生感染的标志，可做为胎内病毒感染的证据。

IgA：呼吸道和消化道粘膜产生的分泌型IgA(sIgA)，可在局部发挥抗病毒作用。

（二）细胞免疫的抗病毒作用

细胞免疫在抗病毒中起着重要作用，可从各种先天性免疫异常患者对病毒感染的抵抗力的差异加以证明。已观察到细胞免疫功能正常而免疫球蛋白缺陷的低丙种球蛋白血症的个体，在感染病毒时，常可与正常小儿表现相同的经过而治愈。与此相反，免疫球蛋白产生正常、细胞免疫缺陷的个体，感染病毒时，常出现严重的后果，甚至连接种痘苗亦可发生疾病。在实验中也证实，摘除胸腺的小鼠或无胸腺的裸鼠，对病毒感染的抵抗力明显减弱。

（三）抗病毒免疫应答的形成和持续时间

病毒感染发生后，干扰素随病毒在细胞内复制而形成，成为机体抗病毒的早期因

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素，但维持时间较短。特异性抗体一般在感染1w后上升。其中IgM较早，消失较快。随后产生的IgG，可长期维持高效价，对防止再感染具有重要的作用。 能引起持久免疫的病毒有：水痘、天花、乙型脑炎、腮腺炎、麻疹、脊髓灰质炎病毒等。

仅引起短暂免疫的病毒有：流感病毒、 鼻病毒等。

八、病毒逃避宿主免疫反应的策略

1、干扰正常细胞调亡：如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒

2、干扰IFN所诱导的蛋白酶：该酶可抑制感病细胞中蛋白质的合成

3、干扰MHC的递呈作用：如HSV-1、EBV

4、直接杀死T淋巴细胞：如HIV

5、改变抗原决定簇结构：如流感病毒的抗原漂移与抗原转换

6、长期潜伏，等待时机：如疱疹病毒

7、隐蔽毒粒，免受袭击：如疱疹病毒能合成Fc受体于外膜，巨细胞病毒外膜的B2-微球蛋白

8、伪装毒粒，搅乱寄主：如麻疹病毒和CMV毒粒可模拟寄主蛋白的抗原决定簇

第十章 癌基因与抑癌基因

一、癌基因的概念

在致瘤病毒、人体和动物肿瘤中发现的可以导致细胞恶性转化的核酸片断称为癌基因。

根据其来源可以分为两类：病毒癌基因、原癌基因（或者细胞癌基因）。

无论病毒癌基因还是细胞癌基因被激活后均有诱导肿瘤发生的作用，所以有时候我们又将肿瘤细胞中的癌基因称为肿瘤癌基因。

病毒癌基因 ( virus-oncogene；v-onco ) 指病毒核酸能够使细胞恶性转化的片断。

原癌基因 ( proto-oncogene，pro-onco ) 在人类、哺乳动物如大鼠、小鼠，乃至酵母、果蝇中发现的与肿瘤病毒癌基因的同源顺序。这种基因是正常的细胞基因，其表达产物的功能在于维持细胞的正常生长发育。但是，这种基因一旦被某些因素激活酒会转变成有转化能力的癌基因。

细胞癌基因概述

细胞癌基因是细胞正常生长、分化所必需的，是生长发育过程中所不可缺少的。 这些细胞癌基因在发育过程中的一定时间、一定组织中定量的表达，产生生命活动中所必需的蛋白质，促进某些生命过程的进行，使生长发育得以实现。这些细胞癌基因在机体生长发育过程完成后多处于关闭状态，即不表达或低表达。一旦在错误的时间，不恰当地点，不适量表达即可能导致细胞无限制的增长而趋于恶性转化。

二、病毒癌基因与细胞癌基因的差别

细胞癌基因：含有内含子或者插入顺序。

病毒癌基因：不含有内含子。

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二者在外显子序列中仅有非常微小的差别，他们的外显子在进化过程非常保守，这表明他们编码的蛋白质产物在进化上的重要性。

三、 病毒癌基因的分类（根据癌基因编码蛋白质功能、性质进行分类） 1 . 蛋白激酶类

酪氨酸蛋白激酶： src、fgr、yes。

丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶： raf、mos、

2 . 生长因子类

sis PDGF-2 ； int-2 EGf 的相似物； erb-B EGf 受体

3 . GTP结合蛋白类

产物具有GTP酶的活性 ras ( H-ras；K-ras )

4 . 核蛋白类

产物与DNA 结合，与复制启动有关 myc ；fos；jun；erb-A

五.癌基因的激活机制

1 点突变：单个碱基突变而改变了编码蛋白质的功能使癌基因激活. K-ras，N-ras，H-ras，12、13、61 codon突变。

2 病毒诱导与启动子插入激活

ALV---鸟类白细胞组织增生病毒,含有LTR ,具有启动子,一旦整合到细胞癌基因c-MYC旁可使之激活。

3 基因扩增

细胞学：1均质染色区（HSR）—染色体某个节段、相对解旋、浅染区,染色体增长 。2双微体（DM）—扩增的DNA脱离染色体、分散、成双的染色质小体 分子水平：基因拷贝倍增。神经母细胞瘤 N-myc。

DNA扩增与癌基因

细胞内一些基因通过不明原因的复制成多拷贝，这些DNA以游离的形式存在称双微体（DMS）或再次整合入染色体形成均染区（HSR），它一般表示染色体结构破坏和不稳定性。基因拷贝数增多往往导致基因表达增多。因此，可以认为基因扩增和过量表达均可影响细胞正常生理功能。

4 .染色体易位或重排（易位激活）

染色体的易位导致癌基因的重排，从而激活癌基因。

最为典型的是 t ( 9q34；22q11 )、t ( 8q24；9q32 )

六．肿瘤抑制基因( Tumor Suppressor Gene)又称为抗癌基因 ( anti-oncogene )抗癌基因的功能是抑制细胞的生长和促进细胞的分化的基因，具体的功能有：诱导终末分化；维持基因的稳定。触发衰老，诱导细胞程序化死亡。调节细胞的生长，抑制蛋白酶活性。改变DNA甲基化酶的活性（甲基化酶可以打开、关闭、基因，甲基化酶也可以引起基因的突变）。促进细胞间的联系。

TSG研究的途径（发现TSG的方法和证据）

1.细胞融合实验。

2.克隆第一个TSG=RB1。

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3.杂合性丢失(Loss of heterozygo-sity, LOH。

4.罕见家族性癌综合征研究

杂合性丢失：从肿瘤细胞的某个染色体区域丢失一个等位基因，而对于该个体正常细胞来说这一区域是杂合性的，肿瘤细胞的这种现象称杂合性丢失。可以用能区分两等位基因的多态标记来检测杂合性丢失。DNA多态标记的杂合性丢失可有助于确定与其紧密连锁的抑癌基因的存在并精确定位.

染色体病和单基因遗传病的患者易于并发或转化为肿瘤，这些遗传病被称为遗传性癌前病变。

小 结

肿瘤的发生既有环境因素的作用，也有遗传因素的作用。

无论是原癌基因还是抑癌基因，都是调控细胞正常生长、增殖与分化的基因。 肿瘤的发生是一个多因素、多阶段、累计渐进的过程。

第十一章 肿瘤遗传学

肿瘤：一群生长失去正常调控的细胞形成的新赘生物（neoplasm）。85%为癌(carcinoma)2%为肉瘤(sarcoma)5%为淋巴瘤(lymphoma)3%为白血病(leukemia)

肿瘤遗传学（Cancer Genetics)应用遗传学的基本原理、方法，从遗传方式、遗传流行病学、细胞遗传和分子遗传学等不同的角度探讨肿瘤发生与遗传的关系,肿瘤防治的新途径，进而开辟一门多学科渗透的新兴学科。

癌发生涉及多个基因的变化。

细胞水平——癌是体细胞遗传病

基因水平——癌是多基因病

癌的发生与常见的复杂性疾病一样，也是由遗传因素（基因变化）和环境相互作用的结果—— 癌是多因素病

癌的遗传事件不是单一而是多途径如DNA甲基化—— 癌是多途径机制

癌的发生经历基因多次突变的累积，其发展是一个多阶段的过程—— 癌是多阶段—— 早发现、早治疗、早预防.

一、化学致癌物是80-90%人类肿瘤形成的病因。大量的动物实验证实：肿瘤发生需要两个主要阶段，即始动阶段和促进阶段。当细胞暴露于一定量的始动剂可能癌变时，标志始动阶段的开始。始动阶段通常是快速的，且不可逆转。促进阶段的特点是肿瘤细胞（始动细胞）的永生化和克隆化。此外，促进阶段的因素（促进剂）不直接影响DNA，故对细胞的影响是可逆的。

（一）始动阶段:肿瘤始动阶段的致癌物是一系列天然的或人工合成的化合物，分为直接作用和间接作用化合物或致癌物前体。前者自身为致癌物，后者通过体内代谢最终转变为致癌物。

（二）促进阶段:当经历始动阶段的细胞暴露于促进剂时，遗传损伤的细胞数将增加。随着持续分裂，这些具有遗传突变的细胞将面临着选择。因此，促进阶段涉及癌前病变细胞的增殖、恶性转化及肿瘤的进展等。

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促进剂不致突变，是通过诱导细胞增殖机制而起到促进肿瘤的作用。

二、辐射

辐射能量，如紫外线或电离辐射，在体外使细胞转化，在体内诱发肿瘤。辐射起致突变作用，通过造成DNA损伤而引起细胞的恶性转化。

紫外线有三种波长：UVA（320-400nm），UVB（280-320nm）和UVC（200-280nm）。UVB易被DNA碱基吸收，引起DNA碱基的改变，被认为与皮肤癌的发生有关。

第二节 肿瘤发生的遗传因素

一.癌家族（Cancer family）

某些癌症具有家族性聚集倾向，表现为一个家系几代人多个成员、同一/不同器官恶性肿瘤许多常见肿瘤如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌等发生，一级亲属再发风险高于一般群体3－10倍。如：Lynch癌家族综合征,Li-Fraumeni综合征.

二.同卵双生子发病一致率研究

77对白血病患者双生子调查:同卵双生者发病一致率高 遗传因素

20对同卵双生子发病部位调查:患者患同一部位的同样肿瘤 遗传因素

三.肿瘤发生率的种族差异

不同种族中某些肿瘤发病率有明显差异例如：鼻咽癌中国人:马来人:印度人=13.3:3:0.4,移居到美国的华人比美国人高34倍。松果体瘤日本比其他民族高十余倍。——种族差异主要是遗传差异所致，在肿瘤发生中也起作用。

第三节 遗传性肿瘤

少数来源于神经或胚胎组织的肿瘤常为遗传性肿瘤。 这些肿瘤按常染色体显性遗传方式遗传，常为双侧性或多发性，发病早于散发型病例。遗传性肿瘤虽然少见，但在肿瘤病因学研究上有重要意义。

同是一种肿瘤,为什么既有遗传型又有散发型?发病年龄又不同呢?

19xx年Knudson为解释家族性(遗传型)视网膜母细胞瘤提出二次突变学说(two hits theory),解释这种现象。

恶性肿瘤的发生需经两次以上的突变。

遗传性病例中，第一次突变发生于生殖细胞，结果个体每一个细胞均带有一个突变，成为突变的杂合子。在此基础上发生的第二次突变是体细胞突变。两次突变累加，即可完成始动（initiation)，而从良性细胞变成恶性细胞。恶性细胞在一定条件下，形成增殖优势，即可完成促进阶段,形成恶性细胞克隆。因此，遗传型病例常为双侧或多发且发病较早。

在非遗传性病例中，两次突变都是体细胞突变，而且必须在同一个体细胞中两次发生独立才能完成始动的过程。这种机会比较少，需要经过漫长过程的积累。因此非遗传性肿瘤多为单发，且发病较晚。

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