实验一植物基因组DNA的提取及其定性定量分析
一、实验目的
通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。
二、实验原理
提取原理：CTAB能溶解细胞膜，在高离子强度下，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行冷冻，研磨、破碎细胞后加入CTAB，将DNA溶解出，用酚、氯仿去除蛋白，经乙醇沉淀得到DNA。
定性原理：琼脂糖凝胶电泳是把DNA样品加入到含电解质的琼脂糖凝胶的样品孔中，置静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。若是DNA分子，在点样孔对应的正极端可观察到透明条带。
定量原理：DNA或RNA在260 nm波长处有紫外吸收峰，吸收强度与核酸浓度成正比。紫外分光光度法还可通过测定260 nm和280 nm的紫外线吸收值的比值估计核酸的纯度。
三、实验步骤
I．提取步骤
1. 将100 mg液氮冷冻条件下的拟南芥嫩叶在1.5 ml EP管内研磨成粉末状。
2. 加0.6 ml 2×CTAB液，混匀，65℃水浴30 min，每10 min颠倒混匀一次。
3. 取出离心管，冷却后加入0.6 ml酚氯仿混合液，混匀。
4. 11,500 rpm室温离心8 min。取400 μl上清液到一新的1.5 ml离心管中。
5. 加入与上清等体积的氯仿，混匀，11,500 rpm 离心8 min，取350 ul上清。
6. 加入600 μl无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30 min。
7. 4℃，15,800 rpm离心20 min，弃上清。
8. 1 ml 70％乙醇(预冷)洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能Vertex，7,000 rpm离心3 min，弃上清，风干(超清台操作)。
9. 加入30 μl无菌水(含20 μg/ml RNase A)，37℃下溶解DNA 30 min。
10. 在一PCR管加5 μl DNA样品和1μl 6×loading buffer，混匀，电泳备用。
II．定性步骤——琼脂糖凝胶电泳
1. 制胶
① 0.3 g 琼脂糖和40 ml TBE缓冲液混合，微波加热至熔化，制0.75％琼脂糖凝胶液。
② 将内槽放置于水平位置，并在固定位置放好样品梳子。
③ 待琼脂糖凝胶液冷却到60℃ 左右时，加入核酸染料1.5 μl，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至板上形成一层均匀的胶面。
④ 室温静置到凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。
2. 加样
用10 μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNA marker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头。
3. 电泳
① 接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极向正极移动。最高电压不超过5V/cm。
② 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。
③ 紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的条带，采用凝胶成像系统拍照保存。
III．定量步骤——紫外分光光度法
(1) 取1μl 样品和19μl ddH2O于1.5ml的离心管中混匀，备用。
(2) 开机，调零。先用0.1×TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击‘set ref’键，仪器自动校正零点。
(4) 吸已稀释的DNA样品转入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“enter” 键。窗口同时显示260 nm和280 nm处的OD值。
(5) 取出石英样品杯，用超纯水清洁石英样品杯，风干，加下一待测样。
四、结果与分析
I．定性结果
CTAB法提取的DNA样品，经过琼脂糖凝胶电泳进行定性分析，结果如下图：
后四个泳道是本小组（第七组）的跑胶结果，对应样品标号是Y， X， S， J。由电泳图可以看出：所有样品经电泳后都提出了DNA，胶孔中没有蛋白质残留，有RNA污染。条带较暗，DNA样品浓度较低，可能的原因是离心后取上清时取的体积过少；移液枪吸干残余的液体时可能带走少量的样品。
II．定量结果
紫外分光光度计法，测得的样品光密度（OD值）如下表：
结果分析：若DNA的A260/A280比值高于2.0，可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。由表知，样品Y的A260/A280为1.83，其中的DNA纯度较好；样品X的A260/A280为2.00，被RNA污染；其余两个样品的A260/A280均低于1.83，纯度差，可能被蛋白质污染。因为1 OD260相当于dsDNA 50 μg/ml，ssDNA 33 μg/ml。本实验提取出的是dsDNA分子，由此计算出样品Y的浓度是2.65μg/ml。
实验二 PCR扩增目的片段
一、实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
二、实验原理
聚合酶链式反应（PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。
三、实验步骤
1．在200 μl PCR 管内配制20 μl 反应体系：
反应物 体积/μl
ddH2O 11.3
10×PCR 缓冲液 2.0
dNTP 1.6
引物1 2.0
引物2 2.0
模板DNA 1.0
rTag 酶 0.1
2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反
应成分集于管底。
3. PCR反应热循环程序设置：
① 94 ℃ 预变性 3 min;
② 94 ℃ 变性 30 sec;
③ 64 ℃ 退火 30 sec; 30 cycles
④ 72 ℃ 延伸 1 min;
⑤ 72 ℃ 延伸 10min;
⑥ 16℃ pause
反应结束后短暂离心，置4℃ 保存备用。
4. 配制0.8％的琼脂糖凝胶。
5. 取5 μl PCR产物，加1 μl的6×loading buffer，轻弹混匀后进行电泳检测。
6. 如果PCR产物非常特异，可以直接用于与载体的重组连接。
四、结果与分析
PCR产物经电泳检测，显示结果如下图：
除Maker外，其余四个泳道是本小组点的样。依次是X，J，S，Y。本图以实验一提取的DNA为模板进行的PCR扩增，只出现一条条带，条带较亮，说明扩增得到目的片段。下面还有一条模糊条带，说明出现了二聚体。
实验三 目的片段和载体的连接
一、实验目的
通过本实验掌握DNA重组连接方法。
二、实验原理
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。DNA重组本质是一个酶促反应过程。即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5′端磷酸和3′端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。一般的连接反应都是在T4连接酶的作用下，有Mg 2+、ATP存在的连接缓冲液系统中，将目的片段与载体进行连接。
三、实验步骤
1. 在灭菌的Eppendorf 管中，加入：
pMD-19 T载体 0.5 μl
PCR产物 4.5 μl
Solution I 5 μl
2. 盖好盖子，用手指轻弹EP管数次，并于台式离心机离心2 sec以集中溶液。
3. 将反应管放入16℃ 连接过夜（12～16h）。
实验四大肠杆菌感受态细胞的制备和转化效率检测
一、实验目的
通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
二、实验原理
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。
CaCl2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，使细胞易于吸收外源DNA。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，之后通过转化实验检测感受态细胞的转化效率。
三、实验步骤
1. 挑取一DH5α单菌落于2ml LB培养基中，37℃过夜培养 。
2. 取其中1ml菌液于一含100ml LB培养基的锥形瓶中，37℃振荡培养2-3 h至OD600值≤ 0.3-0.5。
3. 将菌液转移到50 ml冰浴好的离心管中，冰上放置10 min。4 ℃，3,500 rpm，离心10 min。
4. 倒出培养液，每管菌体悬浮于5ml（1/10）MIXⅠ（务必放冰上）。4 ℃，3,500 rpm，离心10 min，回收细胞。
5. 每管菌体悬浮于1ml（1/50）MIXⅡ，（务必放冰上）。
6. 分装，将感受态细胞分装成100μL一份，置于4℃保存。
四、实验结果
步骤2中，本小组测得OD600值是0.380，满足要求。
实验五重组质粒的转化
一、实验目的
通过本实验，掌握重组质粒的转化方法和原理。
二、实验原理
经CaCl2法制备的感受态细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物 。
本实验采用大肠杆菌 DH5α菌株感受态细胞，与以上实验所得重组连接的质粒载体共保温实现转化。
蓝白斑筛选：载体中有一段大肠杆菌β-半乳糖苷酶的启动子和编码其N端氨基酸（α肽链）的片断基因。宿主具有编码β-半乳糖苷酶的C端基因。当二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为α互补。在诱导物IPTG作用下，由α互补形成β-半乳糖苷酶，可分解培养物中的X-gal使其呈蓝色反应。如果外源基因插入位于LacZ基因内部的多克隆酶切位点中，导致不能编码β-半乳糖苷酶，菌落呈正常的白色。没有插入外源片断的则是蓝色的。
三、实验步骤
1. 取实验三重组质粒10 μl加入100 μl感受态细胞，混匀轻弹，静置冰浴30 min。
2. 将管放到42 ℃ 水浴锅中，热激90 sec。冰浴2 min。加500 μl LB 液体培养基。
3. 37 ℃ 温育45 min ，130 rpm慢摇
4. 在预制的LB 琼脂平板上，加40 μl 20 mg/ml X-gal 和16 μl 50 mg/ml IPTG 溶液。
5. 用灭菌玻璃棒均匀涂布。37 ℃ 温箱中放置30 min。
6. 3,500 rpm，离心2 min。弃约500 μl上清，将剩余菌液轻轻吹打混匀涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，晾至液体被吸收。
7. 倒置平皿37 ℃ 培养12-16h，出现单菌落。
四、结果与分析
经培养，转化成功，板上均长出单菌落。可观察到阴性对照板内不长斑，阳性对照板内长有较多白斑，加了重组质粒的板内长出了分散的白斑和零星的蓝斑，其中白色菌落为含有重组DNA 质粒的菌落。
实验六菌落的PCR鉴定
一、实验目的
通过本实验学习菌落PCR的基本原理与实验技术。
二、实验原理
重组子经过蓝白斑筛选后（具有假阳性），接下来可通过菌落PCR方法对重组子进一步进行快速鉴定。用灭菌后的牙签轻轻粘取白色菌落的部分菌体，在准备好的双蒸水中洗涮一下，充分混匀，取一定量加入PCR反应体系，在PCR反应循环中，95℃ 加热可以使细菌破裂，释放出重组质粒作为PCR扩增模板。采用外源基因特异性引物进行扩增，如果重组质粒转化入宿主细胞，则可以扩增得到预期大小的目的片段。
三、实验步骤
1．用200 μl的枪头挑取转化平板上白色的单菌落于15 μl无菌水中，从中取2 μl菌液作为菌落PCR模板。
在200 μl PCR 管内配制20 μl 反应体系：
反应物 体积/μl
ddH2O 10.3
10×PCR 缓冲液 2.0
dNTP 1.6
引物１ 2.0
引物2 2.0
菌液 2.0
rTag 酶 0.1
2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反
应成分集于管底。
3. PCR反应热循环程序设置：
① 94 ℃ 预变性 3 min;
② 94 ℃ 变性 30 sec;
③ 64 ℃ 退火 30 sec; 30 cycles
④ 72 ℃ 延伸 1 min;
⑤ 72 ℃ 延伸 3 min;
⑥ 16 ℃ pause
反应结束后短暂离心，置4℃ 保存备用。
4. 配制0.8％的琼脂糖凝胶。
5. 取5 μl PCR产物，加1 μl的6×loading buffer，轻弹混匀后进行电泳检测。
四、结果与分析
结果如下图：除两边Maker，其余6个泳道是本小组点的样；对应样品7-1， 7-2， 7-3， 7-4，7-阴，7-阳。
由图看出，样品7-1和7-3转化成功，样品7-2和7-4挑取的是假阳性菌落。
实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定
一、实验原理
碱裂解法的基本原理：细胞膜在碱性环境中迅速溶解。通过离心，染色体DNA由于无法迅速复性，与蛋白质-SDS复合物等一起被沉淀下来；而质粒由于分子量小，空间结构使其即使变性也仍然盘绕在一起，容易复性而溶解在上清液中。
一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。
酶切鉴定原理：限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。
二、实验步骤
1．吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心30s ，弃收集管中的液体。
2. 取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min。弃上清。
3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。
4．加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。操作时间不能超过5min。
5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。12000rpm离心10min。
6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸入沉淀12000rpm离心30s ，弃收集管中的液体。
7. 加入600μL漂洗液（WB）于离心吸附柱中，静置1min后12000rpm离心30-60s ，倒掉废液。 重复一遍。
8. 空管离2min。将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。
9. 滴加50ul elution buffer（EB）至膜中央，室温放置2min后，12000rpm离心1min。离心管中即为纯化后的质粒。
10. 在冰浴上建立酶切反应体系（20 μl）
ddH2O 12 μl
重组质粒 5 μl（本实验提取的重组质粒DNA）
10×NEB Buffer 2 2 μl
EcoRⅠ 0.5 μl
Hind III 0.5 μl
Total 20 μl
限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸混匀，3,000 rpm离心15sec。37℃ 水浴温育90 min。
11. 取2 μl酶切产物，加入4 μl 6×上样缓冲液，混匀。
12. 取5 μl纯化后的质粒，加1 μl的6×loading buffer混匀，与上一步骤的样品一起跑胶，作为对照，也可鉴定目的片段与载体的连接结果。
三、结果与分析
本小组的实验结果如下图：
最后4个泳道，是本组点的样。对应样品：7-质粒，7-1，7-3，7-阳。由图可知，质粒分离成功，该加样泳道只显示出一个条亮带；两个样品及阳性对照均酶切得到目的片段，因为可以看到每泳道可以观察到两个条亮带，是酶切后的目的片段和载体片段，（500bp和2000bp）。但是，样7-1的酶切出现3条带——最上面的条带，可能是由于酶切不完全造成的，原因可能是酶切时间不够，也可能是由于酶的浓度过低或者质粒浓度过高，部分质粒未被切开，出现上面未切开的质粒条带。