分 子 生 物 学
实验报告
班级：20##级生物科学（师）2班
组别：第二小组
组长：
组员：
20##年11月
从基因组中获得甘薯ADK基因
(生命科学学院,西南大学,重庆 400715)
摘要：从新品种渝苏303甘薯幼苗中提取出总RNA，然后反转录形成cDNA第一链，接着进行PCR扩增ADK基因核心片，回收该片段，与T载体连接，转入处于感受态的大肠杆菌DH5α体内，PCR检测筛选阳性转化子，判断该载体是否进入大肠杆菌体内。
关键词：甘薯；cDNA；PCR；ADK基因；大肠杆菌
To Obtain the ADK gene from the sweet potato
Zhu Xiaolin A limu·Yakupu Deng Yaling Bao Jiali Peng Jinyao Zhang Yane
(School of Life Science, Southwest University, Chongqing)
Abstract: Firstly, we obtain the whole RNA from the new varieties of sweet potato which is called 303 Yusu.Then we acquire the first chain of cDNA through reverse transcription. Next, we get a mass of the ADK core gene after PCR. Fourthly, the target gene fragment was recovered and be connected with T carrier. The complex will be transferred into E.coli that is in competence. In order to detect whether the T carrier is be transferred into the E.coli or not, we should filtrate the positive transformant by PCR.
Key words: sweet potato; PCR technologies; ADK gene; E.coli
1 综述：
甘薯 学名：Ipomoea batatas Lam. 英文名：Sweet Morningglory 又名叫地瓜、红薯、番薯、白薯、甜薯、红苕、红芋等, 属旋花科甘薯种、蔓生性草本植物, 产量仅次于马铃薯, 是世界十大农作物中第二位, 我国从南到北、从东到西, 广为种植, 普遍食用。红薯是世界十大农作物之一, 在人们生活中有一定地位, 它营养全面均衡, 碳水化合物、18种氨基酸, 大量纤维素、蛋白质、脂肪、维生素、微量元素等等。它能抗衰老, 防治现代病等。
“渝苏303”是西南师范大学在育成“ 渝苏1号” 、“ 渝薯34”、“ 渝薯20” 之后,于1991年从江苏省农科院提供的"B58-5 X苏薯1号"组合的杂交种籽中选育而成，原系91-31-303。 “渝苏303”具有较好的丰产性和适应性, 在试验中其藤叶、薯干、生物鲜产、生物干产、淀粉产量和在生产试验、台位试验中的鲜薯产量均增产,尤以淀粉、藤叶产量增产幅度最大并且, 该品种具有萌芽性较好, 结薯习性好, 大中薯率高, 薯块烘干率和出粉率高, 抗黑斑病和根腐病, 高抗茎线虫病, 贮藏性好的区试结果。
ADK即腺苷酸激酶(EC.2.7.4.3，adenylate kinaSe，ADK)，它是平衡腺苷酸代谢库的关键酶, 能够催化AMP+ATP 形成2 分子ADP 的可逆反应, 是调控这三种前体分子在淀粉代谢库和核酸代谢库中分配的关键酶，其表达量直接影响腺苷酸在糖类代谢库和核酸代谢库中的分配。生物信息学分析表明, 在淀粉合成水平最高的植物中, 腺苷酸激酶的分子进化水平和遗传相似性也最高，因此, 作为腺苷酸代谢库调节中枢的ADK 基因( adk) 是淀粉代谢工程的重要候选基因, 将该基因表达量控制在较低水平就可打破腺苷酸代谢库的平衡, 使腺苷酸代谢流向淀粉合成的方向流动。用基因工程技术获得的含有ADK基因工程菌菌株可用于遗传转化马铃薯、甘薯和木薯等重要的淀粉作物, 为实现淀粉代谢工程奠定了基础。
本次试验就是利用从甘薯“渝苏303”中提取总RNA,反转录出cDNA第一链，通过PCR对adk基因进行扩增，然后对adk基因进行胶回收，，通过连接制备重组DNA，然后导入到大肠杆菌细胞中，通过筛选检测目的基因是否转化成功。本次实验涉及总RNA和DNA的提取，PCR扩增adk基因及检测，adk基因回收与连接，大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备，连接产物的转化筛选和PCR检测，以及选做实验质粒DNA的抽提与酶切，原理上根据目的基因的制备，重组DNA分子的构建，重组DNA分子转移到受体细胞，转化子的筛选，和目的基因表达与功能的鉴定的操作步骤，从分子层面直观的告诉我们了基因工程技术中的操作方法和实现手段。
技术路线：
2 实验用具：
2.1植物材料
（1）渝苏303为西南大学重庆市甘薯中心利用甘薯近缘野生种Ipomoea trifida与甘薯进行的种间杂交选育而成的淀粉用甘薯品种，通过国家及四川、重庆、江西、江苏品种审定委员会审定，并在生产中得到了大面积推广。
华北52-45 南瑞苕
徐薯18 新大紫 胜利百号
B58-5 Y10(I.trifida.2n=6x=90)
H11-67 南瑞苕
渝苏303 华北52-45
胜利百号
南瑞苕
苏薯1号
华北52-45
图1.渝苏303系谱图
Fig I Genealogy of Yusu 303
（2）工程菌：大肠杆菌DH5a菌株
2.2 试剂药品及仪器
2.2.1试剂药品
CTAB抽提液：2%（w/v）CTAB，100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20 mmol/L EDTA(pH8.0)，1.4 mol/L NaCl
醋酸钠：3 mol/L NaAc（用冰乙酸调pH值至4.8-5.2）
TE溶液：100mmol/L Tris-HCl，1.00 mmol/L EDTA（调pH值至8.0 ）
LB培养基的配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠(NaCl) 10g/L，琼脂粉，卡那霉素
电泳配方：琼脂糖1g，100ml电泳缓冲液（TAE），
液氮100L，Taq DNA聚合酶，10×PCR buffer，25mmol/lMgcl2，0.225mmol/ldNTP， 10umol/l引物，模板DNA分子（0.1-2ug/ul），LB培养基卡那霉素储存液，marker(DL2000)1支，Amp，Cm，T-Easy Vector，LB培养基液体20mL，蛋白胨1瓶，酵母提取物1瓶，NaCl 1瓶，甘油100mL，CaCl2 1瓶，ddH2O，限制性内切酶，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，常规PCR试剂1套，质粒小量提取试剂盒1个，总RNA提取试剂盒1个
2.2.2仪器设备
PCR扩增仪，PCR用薄壁管，移液枪及电泳仪，酒精棉球，恒温水浴锅，锥形瓶3个，室内使用的大中型枪头各1盒，两面板（蓝板）1个，浮标1个，室内使用的1.5mL的EP管1盒，凝胶成像系统1台，大中小型枪头各1盒，涂布器1根，THZ-C水平摇床1台，封口膜1盒，LB+Amp平板1个，LB+Cm平板1个，LB+ Amp + Cm平板1个，一次性PE手套1袋，研钵﹑杵1个，药勺1把，，引物3对，计时器1个，电泳仪1台，水浴锅1台，λDNA/HindⅢ1支，大小离心机各1台，恒温培养箱1台，酒精灯1个，超净工作台1台，THZ-C水平摇床1台，冷冻离心机1台等。
3实验方法
3.1 RNA 的提取
按照TIANGEN公司的RNAsimple Total RNA Kit（总RNA提取试剂盒）产品说明书所述步骤运用试剂盒产品进行实验操作。
3.2 反转录扩增目的基因与检测
按照TIANGEN 公司的TIANScript RT Kit的实验说明上所述步骤用其产品进行实验操作。
3.3 核酸片段的回收与连接
按照TIANGEN公司的TIANgel Midi Purification Kit（普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒）产品说明书上所述方法对其进行检测并将可使用的DNA进行回收、纯化及检测。
3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
按照分子生物学实验指南（生物工程与生物技术教研室）实验四中的CaCl2法，感染预先准备的大肠杆菌DN5α菌株。
3.5 连接产物的转化、筛选及PCR检测
按照分子生物学实验指南（生物工程与生物技术教研室）实验五中的方法步骤，进行连接后DNA的转化、筛选及PCR检测。
3.6 DNA的粗提取与检测
按照分子生物学指南（生物工程与生物技术教研室）实验一中的方法步骤，进行实验操作。
4结果与分析
4.1提取RNA时电泳检测：
（1）结果说明：从实验所得条带可以看出，我们班提取的RNA经电泳后均可以看到28s、18s、5s 3条带，但我们第二组提取的RNA不能明显看到理想的很亮的28s、较亮的18s、很淡的5s 3条带，而是28s和18s的条带亮度较小，5s的条带亮度较高，可能是提取的过程中有一些RNA已经发生了降解，裂解成为较小的片段。
（2）结果分析：原因可能是在提取RNA的过程中，旁边有人说话和操作工程中动作不规范，RNA酶接触实验材料，使得RNA部分降解。
（3）但所提取的RNA仍可用于后续实验操作。
4.2反转录后PCR扩增adk基因核心片段电泳分析：
（1）结果说明：上图红色框内为我们组的实验结果，可以看出电泳后出现了亮带，且亮度适中。说明目的基因扩增较为成功。
（2）结果分析：
条带亮度稍微偏暗，说明扩增产物浓度不是很高，其可能原因是操作过程不规范导致扩增出的cDNA 片段较少；
目的片段下部有一些较淡的条带片段，可能是扩增过程中出现的杂质条带；
有三个组未出现核心片段的条带，可能是由于进行PCR扩增的时候某种材料出现了问题，未扩增出cDNA片段，故看不到亮带。
（3）琼脂糖凝胶电泳检测的结果中较亮的条带所对应的凝胶部分可用于下步核酸片段的回收。
4.3 菌落筛选：
由实验现象可知，经培养长出了许多具有抗性的菌落，且平板一上培养基的边缘有一些生长状态良好的大肠杆菌单菌落，在后续实验中可挑取平板1中的菌落来进行进一步的检验。
平板上所长菌落较多，可能是配培养基所用的卡那霉素失效，没有很好的抑制没有卡那霉素抗性的细菌的生长。
4.4菌检PCR图：
上图中红色方框里的即为我们小组所得的菌检结果，由实验现象可以看出成功得到亮带，说明结果为阳性，含adk基因的质粒环进入了大肠杆菌中。总体来说实验比较成功。
其他有些没有亮带出现的原因可能是：
<1>含有adk基因的质粒未能进入大肠杆菌，或者数量太少。
<2>挑取菌落有随机性，也许恰好没有挑取到含有adk基因的质粒的菌落。
4.5 DNA的粗提取电泳图：
上图左起第一个为我们小组DNA凝胶电泳条带，可以看到条带比较清晰，且在点样处及DNA亮带下面亮色条带不明显，说明我们组提取的DNA较纯，蛋白质、RNA这些杂质很少。提取很成功。
由于是DNA粗提，所以其中会有RNA和蛋白质这些杂质，因此有些组出现了三条带，按照它们的分子量大小，跑的最快的应该是RNA，处于中间的是DNA，最后的处于点样处的为蛋白质。
第一组的DNA中加了RNA酶，故DNA的条带更为清晰，杂质很少，也为其他组的结果中RNA的鉴定做出了很好的对照。
5 参考文献
[1] 生物工程与生物技术教研室. 分子生物学实验指南-6
[2]-张启堂，付玉凡等. 甘薯新品种_渝苏303_选育研究.西南师范大学学报（自然科学版）.1999.12
[3] 张洪杰等.腺苷酸激酶的脲激活及构象变化.中国科学.1998.4
[4] 静恩.周波等.腺苷酸激酶基因在大肠杆菌中的可溶性高表达.生物化学与生物物理进展.1997.
[5] 宓庆梅 许绍辉等.荧光分光光度法测定血清腺苷酸激酶活力. 临床检验杂志1998 年第16 卷第3 期
第二篇：PCR实验报告(分子生物学实验)
PCR
Lin Chengyu Bio 04 2010030007; Cooperator: Yuan Xiaowen
Experiment date: 2012-03-22 Submit Date: 2012-03-23
1 Introduction
1.1 Background information
PCR (polymerase chain reaction) is a technique for amplifying DNA sequences in vitro. It was invented by Kary Mullis and his colleagues in 1985. It is widely used in gene cloning, mutation, sequencing and detection.
1.2 Objectives
(1) Learn the principle and method of PCR (Polymerase Chain Reaction).
(2) Comprehend the significance of PCR technique in DNA manipulation.
1.3 Major principles
One typical PCR cycle consists of three steps: denaturation, annealing and extension.
(1) Denaturation
Figure 1 Step 1: denaturation
As shown in Figure 1, the target double-strand DNA can be separated into single-strand DNA under high temperature (about 50 ℃).
(2)
Annealing
Figure 2 Step 2: annealing
As shown in Figure 2, when temperature is lower, the forward and reverse primers will bind to the single strand DNA, which are about 20 nt long, designed to be complementary to the both end of the target gene and often has restriction enzyme recognition sites at the 5’ ends.
(3) Extension
Figure 3 Step 3: extension
As shown in Figure 3, when temperature rise to about 72 ℃, which is the optimal temperature of Taq, one kind of DNA polymerase working in high temperature. The discovery of Taq DNA polymerase is fundamental to PCR. As a result,
new DNA
strand complementary to the target DNA will be synthesize at the end of 3’ ends of the primer until temperature rise to denature the double strand again.
2 Experiment Operation
2.1 Material
(1) pCMV-Myc-T10 (SIPAR), 10 ng;
Figure 4 Plasmid profile (pCMV – Myc)
(2) Forward and reverse primer, 1 μM;
Figure 5 Forward primer
Figure 6 Reverse primer
(3) DNA polymerase: rTaq, 5 U / μ
l.
2.2 Chemicals and apparatus
2.2.1
Solutions
Table 1 Solutions
2.2.2 Apparatus (1) Pipettes; (2) PCR systems;
(3) Eppendorf tubes; (4) Centrifuge;
(5) Gel electrophoresis apparatus; (6) UV gel imaging system; (7) Biodev PCR purification kit.
2.3 Procedure
2.3.1 PCR
(1) Add all 7 kinds of materials or solutions into PCR tubes following Table 2;
Table 2 50 μl system for PCR
(2) Put the tubes into the instrument for PCR, set program as Table 3;
(3) Take out the tubes when program stops.
2.3.2 Agarose gel electrophoresis
(1) During PCR, place a clean electrophoresis mold on a horizontal surface, carefully insert a comb (15 μl slots) into the mold;
(2) Pour the agarose gel solution (contains 1.0 g agarose in 100 ml TAE) into the mold gently to avoid bubbles. The height of gel shall be slightly higher than the black line on the side face;
(3) Wait for approximately 30 min for solidification, when PCR complete as well;
(4) Add 4 μl 3×Loading buffer, 4 μl ddH2O and 4 μl PCR product to a piece of sealing film, and mix with pipette;
(5) Carefully remove the comb, place the mold in the electrophoresis chamber, and add 1×TAE buffer in order to cover the gel to a depth of approximately 1 mm;
(6) Load 15 μl solution into the slots of the gel: one slot for one tube. Load 4 μl of 1kb DNA ladder into the slot beside the sample;
(7) Start electrophoresis immediately samples loading at 100 V, and stop when Bromophenol blue is 2/3 gel length from the starting line;
(8) Place the gel into EB working solution for 20 min, and observe under UV at 310 nm. The red fluorescent bands show where DNA is and their darkness show the quantity. Then take photograph for records;
2.3.3 PCR product purification
(1) Add 50 μl PCR product to 400 μl Binding buffer, and mix with pipette;
(2) Transfer the solution to the mini-spin column, and centrifuge at 12,000 rpm
for 30 sec. Discard the waste solution in the collection tube;
(3) Add 450 μl Washing buffer to the mini-spin column, and centrifuge at
12,000 rpm for 30 sec. Discard the waste solution in the collection tube;
(4) Repeat Step 3 once more;
(5) Centrifuge at 12,000 rpm for 2 min to get rid of ethanol;
(6) Add 40 μl ddH2O to the center of the mini-spin column, put the column in a
new Eppendorf tube, and incubate for 1 min. Then centrifuge at 12,000 rpm for 1 min.
(7) Preserve the product under -20 ℃.
3 Result
Figure 7 PCR product agarose gel electrophoresis:
Lane I – Product of Yuan
Lane II – Product of Lin
The target gene, together with restriction enzyme recognition sequence added in the primer, is about 0.9 kb long, which corresponds with the band in Figure 7.
4 Conclusion
The PCR product contains the target gene we want to amplify in the template, and its quantity is enough for the following operation.
5 Reference
【1】Liu Jinyuan, Zhang Shuping, Wu Yaoting, Introduction of Molecular Biology
Experiment.