质粒DNA的提取，纯化及验证

陈倩倩  学号：118627140313

一，实验目的：1，掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。

2，掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

二，实验原理：碱变性提取质粒DNA一般包括三个步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分解和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

三，实验仪器试剂和材料：

恒温振荡培养箱， 高温冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml离心管，不同型号吸头，微量移液管等

菌体：E.coli  DH5α受体菌

试剂：LB培养基，氨苄青霉素，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液，上样缓冲液。

四，实验步骤及现象

①      准备灭菌

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分子生物学实验报告

 

目   录

实验一 细菌的培养... 2

实验二 质粒DNA的提取... 4

实验三 琼脂糖凝胶电泳法检测DNA.. 7

实验四 质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定... 9

实验五 聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA.. 11

实验六 植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析... 14

实验七 RNA分离与纯化... 17

实验八 RT-PCR扩增目的基因cDNA.. 19

实验九 质粒载体和外源DNA的连接反应... 21

实验十 感受态细胞的制备及转化... 23

实验十一  克隆的筛选和快速鉴定... 25

实验十二 地高辛标记的Southern杂交... 27

实验十三 阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达... 31

思考题... 32

分子实验心得总结... 33

实验一 细菌的培养

一、目的

学习细菌的培养方法及培养基的配置。

二、原理

在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。

大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到1×10⁹~2×10⁹/mL。

培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。

三、实验材料、试剂与主要仪器

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实 验 报 告

科目：分子生物学实验

姓名：　　　  实验组：　　

学号：               

单位：　　　　　　　　

学院：　生命科学学院　　班级：20120513

20##年9月至11月

实验一  从cDNA文库和克隆质粒中扩增靶片段

第一部分   准备实验

一、介绍实验室的规章制度、注意事项

二、准备实验

1.   分组，分发实验服、试验用具

2.   讲解注意点：戴手套操作

3.   准备枪头：装盒，灭菌

4.   各个型号的EP管和PCR管的灭菌

5.   双蒸水灭菌

6.   洗净培养皿、摇菌小三角瓶、试剂瓶等

第二部分 利用PCR技术从特定质粒中扩增靶片段

一、实验目的

通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。

二、实验原理

一）引物的设计：

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：

1.引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

3.长度
   寡核苷酸引物长度为15～30bp，一般为20～27mer。引物的有效长度：Ln=4（G+C）+2（A+T），Ln值不能大于76，因为>76时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃)，不能保证产物的特异性。

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蛋白质SDS-PAGE分离和Western Blot

一、 实验目的

1． 掌握SDS-PAGE分析的原理和技术，应用于蛋白质的分析和鉴定。

2． 实验采用HL60细胞总蛋白作为材料，进行SDS-PAGE后，用半干式转移法将蛋白质转移到PVDF膜上，应用Western Blot分析技术，分析PVDF膜上的c-Myc蛋白。通过本实验，掌握半干式转移的操作和Western Blot的基本原理和操作技术。

二、 实验原理

1. 蛋白质SDS-PAGE原理

聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合而成。化学聚合的催化剂通常多采用硫酸铵或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为N,N,N’,N’,-四甲基乙二胺（TEMED），在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成的氧自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。聚丙烯酰胺凝胶的机械强度好，有弹性且透明，相对的化学稳定，对PH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广范的范围，并且之制备凝胶的重复性好。

聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE分离蛋白质的方法有很多种。本实验采用SDS-PAGE法。SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g 蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电，是各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分力量的函数。 不同的凝胶浓度合适用于不同的分子量范围，可根据所测分子量范围选择最适合的凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样本相近的蛋白质作为标准蛋白质。

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PCR基因扩增

实验目的：通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

实验原理：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。

实验仪器：基因扩增仪 移液器

实验试剂：

 10×PCR缓冲液(含Mg2＋) 

 4种dNTP   

 Taq酶

DNA模板

两种引物（正向引物和反向引物） 

实验步骤:`

1、按顺序向微量离心管中依次加入：

ddH2O 20μl

 DNA 样品5μl

 10×PCR 缓冲液5μl

dNTP 4μl

 引物I 5μl

 引物Ⅱ 5μl

 混匀。

2、PCR反应参数

 (1) 94℃变性2min

 (2) 94℃变性30sec，

 (3) 66℃退火30sec，

 (4) 72 ℃延伸1min。

 (5) 重复(2)-(4)40次

 （6）72 ℃延伸7min。

 （7）4℃保存

3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10μl PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。保持电流40mA。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果。

实验结果：照片结果图

 

1.10ul样品

2.样品

3.DNA相对分子质量标准

4.对照

DNA琼脂糖凝胶电泳

实验目的：通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA在碱性的溶液中带有负电荷，因此，在电场作用下朝正极移动。在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。

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分子生物学

实 验 报 告

200X级生物XX专业       XX班

实验X组

组长:  XX              22200731724XX

组员:  XX              222007317242XX

              XX       222007317242XX

       XX       222007317242XX

                   XX            222007317242XX

XXX年X月

从基因组中获得甘薯ADK基因

XX,XX,XX,XX,XX

(西南大学,生命科学学院,重庆 400715)

摘要：从甘薯的新品种渝苏303中提取基因组DNA。先以此DNA片段为模板使用PCR技术在体外扩增扩增获得 adk 基因核心片段，再扩增目的基因片段通过琼脂糖凝胶电泳并回收，在16℃与T载体连接30min以上用于转化DH5α感受态。-----------。

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华中科技大学生命科学与技术学院

分子生物学实验报告

专业 班级 姓名 学号 日期 成绩

实验一 质粒的小剂量提取——碱裂解法

实验原理：

质粒(Plasmid)是独立于细菌染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子，是一种环状的双链DNA分子，大小为1-200千碱基对(kb)，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多，在细胞中一般以游离超螺旋状存在。质粒具有自主复制性、不相容性、多拷 贝性、转移性、选择性遗传标记、质粒DNA链上有1到几个限制性内切酶单一识别位点等特点。它可独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。

质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“严谨型”；二是“松驰型”。

1.严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；

2.松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。

质粒的提取有多种方法。本实验采用碱裂解法 进行质粒的小量制备。碱裂解法是常用的质粒的小剂量提取法，它的原理是：在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当用酸性的高盐缓冲液将pH中和至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型并溶解在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，缠结的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。上清液中的质粒DNA因不溶于70％的乙醇，可在加入乙醇后通过离心得到质粒DNA沉淀

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