斑点－酶联免疫吸附试验检测猪繁殖与呼吸综合征

病毒抗体

生命科学学院 08动物医学

2008082518 李文飞 指导老师：邱龙新

【摘要】 19xx年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。【2】

【关键词】免疫 技术 试剂 新型

1、ELISA定义及其简介

酶联免疫吸附试验 (ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。有三类，竞争法、双抗体夹心法和间接法。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。

自从Engvall和Perlman（1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。尽管早期的ELISA由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。 目前ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。

2、原理

ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的

供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；

（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；

（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，正因为此种放大作用而使本法具有很高的

【4】敏感性。因此，ELISA法是一种既敏感又特异的方法。

3、步骤

方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

1. 包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。

2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。

4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测

OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二 用于检测未知抗体的间接法：

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，

每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。

↓

加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔

中,置37℃孵育1小时,洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）

↓

于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，

37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。

↓

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

方法三 用于测定抗原，也可用于测定抗体的竞争法

（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。

待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。

（2）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。

【3】

4、应用：猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒

4.1、简介

试剂盒由抗原包被的微孔板，酶标羊抗猪IgG及其它试剂制成，应用间接ELISA原理检测猪血清中抗蓝耳病N蛋白的抗体。

4.2、用途

猪蓝耳病ELISA诊断试剂盒用于检测猪血清中抗蓝耳病N蛋白的抗体。评估猪场蓝耳病疫苗免疫状况。感染猪的血清学诊断。

4.3、原理

本试剂盒是采用猪蓝耳病病毒N基因的基因工程表达产物包被检测板。在试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后，若样品中含有猪蓝耳病N蛋白的特异性抗体，则将与检测板上抗原结合，经洗涤除去未 结合的抗体和其他成分后；再加入酶标二抗，与检测板上抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物，在孔中加TMB底物液，与酶反应形成蓝色产物，加入HF溶液中止反应后，用酶标仪630nm波长测定各反应孔中的OD值。

4.4、试剂盒主要成分

1 包被抗原的检测板 2块 （96孔/板） 2 阴、阳性对照血清 各1管 （1ml/管） 3 抗猪IgG-HRP结合物 1瓶 （20ml/瓶） 4 20倍浓缩洗涤液 1瓶 （30ml/瓶） 5 底物A液、B液 各1瓶 （10ml/瓶） 6 终止液 1瓶 （10ml/瓶） 7 样品稀释液 1瓶 （50ml/瓶） 8 血清稀释板 2块 （96孔/板） 9 说明书 一张

4.5、样品制备

取动物全血，按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血。

4.6、洗涤液配制

使用前，浓缩的洗涤液应恢复至室温（25℃左右）,并摇动使沉淀的盐溶解（最好在37℃水中加热5-10），然后用蒸馏水或去离子水作20倍稀释（例如：每板用20 ml浓缩液加上380ml水），稀释好的洗涤液在4℃可以存放7天。

4.7、样品稀释

在血清稀释板中按1：40的体积稀释待检血清（例如：195μl样品稀释液中加5μl待检血清）。

注意：阳性和阴性对照1：4稀释，（例如：180μl样品稀释液中加60μl对照血清，吹打均匀）。

4.8、注意事项

1 试剂盒使用前各试剂应平衡至室温，使用后放回2-7℃。

2 不同批号试剂盒的试剂组分不得混用，使用试剂时应防止试剂污染。

3 不要用口移液。

4 TMB（底物液B）不要暴露于强光和避免接触氧化剂。

5 检测板拆封后避免受潮或沾水(未用完的抗原包被板加干燥剂放于自封袋中，应尽快 置 于4℃)。

6 待检血清样品数量较多时，应先使用血清稀释板稀释完所有要检测血清，再将稀释好的 血清转移到反应板，使反应时间一致。

7 浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释，如果发现有结晶加热使其溶解后再使用。 8 在操作过程中移液时，切忌将气泡加入检测板孔中。

9 严格按照操作说明书可以获得最好的结果，操作过程中移液，定时和洗涤等的全过程必须精确。

4.9、操作步骤

1 取预包被的检测板（根据样品多少，可拆开分次使用），将稀释好的待检血清取100μl加入到检测板孔中。阴性对照和阳性对照各设2孔，每孔100μl。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育30分钟。

2 甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板5次，200μl/孔，每次静置3分钟倒掉，再在干

净吸水纸上拍干。

3 每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP结合物）100μl，置37℃温育30分钟。

4 洗涤5次, 方法同2。切记每次在干净吸水纸上拍干。

5 每孔先加底物液A一滴（50?l）、再加底物液B一滴（50?l），混匀，室温(18℃-25℃)避光显色10分钟。

6 每孔加终止液1滴(50μl)，10分钟内测定结果（检测前在震荡器上轻轻震动一下）。

4.10、 结果判定

在酶标仪上测各孔OD630值。试验成立的条件是阳性对照孔平均OD630值大于或等于 1.0，阴性对照孔平均OD630值必须小于0.3。

样品OD630值大于0.42，判为阳性；样品OD630值在0.38到0.42之间，判为可疑；样品OD630值小于0.38，判为阴性。

注意：用620 ~650纳米波长测定结果均有效。

4.11、贮存：2-8℃避光保存

【1】

5 、 总结

本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：

5.1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。

5.2、研究抗酶抗体的合成。

5.3、显现微量的免疫沉淀反应。

5.4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

参考文献：

【1】 王生育,李建辉,孔繁德,黄印尧.酶联免疫吸附试剂盒与免疫金标快速检测试纸检测PRRS抗体的比较[J].福建畜牧兽医，2003，4（6）.

【2】 刘书亮,王红宁.PRRS的病原学和免疫学研究进展[J].四川畜牧兽医，2000，3

（1）.

【3】 蔡家利.猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗株基质膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白基因的研究[D].南京农业大学，1998.

【4】 吴加强.猪繁殖与呼吸综合征病毒resp株增殖条件的优化及其高免血清与单克隆抗体的研制[D].南京农业大学，2001.

第二篇：分子生物学综述1

分子生物学综述

《肌萎缩侧索硬化症的基因分析和基因治疗进展》

姓名：胡莉琴

学号：416522811456

专业：神经病学

单位：南昌大学医学部

肌萎缩侧索硬化症的基因分析和基因治疗进展

ABSTRACT: OBJECTIVE: Explore amyotrophic lateral sclerosis in the virulence genes and gene therapy are reviewed. DATA SOURCES: An computer-based online search of Pubmed database was undertaken to indentify articles published in English between 1993 and 2011 by using the keywords of “amyotrophic lateral sclerosis,gene,gene therapy” Chinese relevant article published from 2005-2011 were searched with computer in WEI PU. STUDY SELECTION；The data were checked firstly, the articles on amyotrophic lateral sclerosis were collected. Inclusive criteria: ①Research amyotrophic lateral sclerosis of virulence genes; ②Amyotrophic lateral sclerosis gene therapy research. Exclusive criterial:①Drug therapy; ②repetitive studies and experiential and individual literature report. DATA EXTRACTION: Totally 116 articles in all on amyotrophic lateral sclerosis were collected ,of which 32 articles were selected. DATA SYNTHESIS: The pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis and SOD1 gene mutations may be relevant. When SOD1 genetic change, its code of protein conformation also produces change, enzyme activity reduced, scavenging free radicals ability. In amyotrophic

lateral sclerosis gene therapy, neural factor can promote motor neuron in the survival and growth and repair, iRNA can delay the motor neuron degeneration of the development.

CONCLUSION: For amyotrophic lateral sclerosis to explore its pathogenesis, for ALS gene therapy to lay the foundation, thus heal ALS. KEYWORDS: amyotrophic lateral sclerosis ;gene; gene therapy 摘要：

目的： 探讨肌萎缩侧索硬化症在致 基因和基因治疗方面的研究进展。 资料来源：应用计算机检索Pubmed1993-20xx年的文章，检索词为“amyotrophic lateral sclerosis,gene,gene therapy”,限定语言种类为中英文，同时计算机检索维普数据库2005-20xx年期间的相关文章。 资料选择：对资料进行初审，选取有关肌萎缩侧索硬化症方面的研究。纳入选标准：1.研究肌萎缩侧索硬化症的致病基因等方面的研究。2肌萎缩侧索硬化症的基因治疗的研究。排除标准：1.药物治疗的研究。2.重复研究及经验和个人报告文献。 资料提炼： 共检索到116篇关于肌萎缩侧索硬化症致病基因及基因治疗等研究的文献，入选32篇。 资料综合： 肌萎缩侧索硬化症的发病机制可能和SOD1基因突变有关。当SOD1基因发生改变时，其编码的蛋白质构象也发生变化，酶活性减低，清除自由基能力下降。在肌萎缩侧索硬化症的基因治疗方面，神经因子可以

促进运动神经元的存活和生长及其修复，iRNA可以延缓运动神经元的变性发展。

结论：对于肌萎缩侧索硬化症要不断探索其发病机制，为ALS的基因治疗打下基础，从而治愈ALS。

关键词：肌萎缩侧索硬化症;基因；基因治疗

0 引言

肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是运动神经元病的主要类型，以脊髓前角和脑干运动神经核的运动神经元以及锥体束的慢性进行变性，上下运动神经元同时受损为特征。男性患者多见，一般在40~50岁起病，发病后3~5年死亡。主要表现为脊髓和脑干所支配的肌肉无力、萎缩、肌束震颤、球麻痹和锥体束征；感觉系统一般不受累。目前ALS的病因和发病机制不明，也无特效治疗。而分子生物学研究的迅速发展为ALS提供了新的治疗策略。本文就近年来关于ALS的基因突变和基因治疗的研究进行了综述。

1.新致病基因的发现和遗传学研究的进展

SOD1基因突变与ALS有关已经被公认，在散发病例中占1%-4%，在家族遗传病例中占20%左右。在家族ALS中是否存在其他的基因突变一直是学者们研究的重点。美国的Brown对16个没有SOD1基因突变的常染色体显性遗传的ALS家族进行基因连锁分析，发现第16号染色体至少有3个新的突变位点，还提出16%的ALS患者可检测到SMN2基因。

家族性的ALS(FALS)分12种亚型：ALS1-ALS8、合并ALS的额颞叶痴呆综合征、X性连锁遗传的ALS、ALS痴呆帕金森综合征、进行性下运动神经元病等[1]。在不同的人群，约12-13%FALS

和2%-7%的散发性ALS（SALS）患者有铜∕锌超氧化物歧化酶（SOD1）基因突变[2]。国内李晓光等发现FALS的E133V和H46R基因突变位点；在AL中，发现了V29A、N861和V47A突变位点。樊东升等发现作为本病易感基因的VEGF启动子区多态分布与欧美白人不同，且在中国人群中发现VEGF启动子区多态分布与起病年龄明显相关[3]。

目前还发现3个与FALS相关的基因，ALS1基因的SOD1，ALS2基因Alsin和ALS4基因Senetaxin。中国目前尚未见一个FALS位点报道，仅发现1例SOD1突变[4]，提示中国ALS具有与西方不同的发病机制，有不同的基因导致中国FALS的发生。

2 SOD1基因突变的特点

SOD1基因组DNA长12kb，含有5个外显子编码153个氨基酸，组成33ku的金属酶蛋白，具有清除自由基和抗氧化的功能。在FALS患者中，SOD1基因的2号外显子编码区发生插入突变导致mRNA的转录提前终止，使翻译至第36号密码子时遇到终止密码子TAA，从而使SOD1蛋白质翻译提前终止。正常的SOD1蛋白由153个氨基酸组成，而突变后的SOD1蛋白质为35个氨基酸组成的短肽。

新突变的SOD1二级结构基本上保持了野生型SOD1中对应区域的二级结构，但改变了SOD1蛋白结构的整体活性，导致突变的SOD1蛋白的抗氧化损伤作用减弱，自由基产生增多，使细胞膜、线粒体、轴突受损，影响轴浆运输[5、6]。

3 基因治疗

3.1 神经营养因子的治疗

随着对ALS研究的不断深入，神经

营养因子在ALS 治疗中的作用逐渐受到重视，如睫状神经营养因子（CNTF）、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、脑源性

神经营养因子（BDNF）以及胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等。多项研究表明，CNTF可延缓Wobbler小鼠疾病的发展，减少肌萎缩，促进运动神经元存活和生长[7、8]，但临床结果不满意[9、10]。研究表明，IGF-1可以促进神经元修复，增加损伤后脊髓运动神经元的存活率[11]。Sakowsk等通过对ALS患者进行IGF-1治疗后发现，它可以延缓ALS的进展且对身体无副作用【12]

。但最近一项研究表明，皮下IGF-1治疗并不能延缓ALS疾病的进展[13]。BNDF 在大脑神经元及胶质细胞中合成，可以明显增大神经元胞体和促进轴突的生长。体外研究证实，100ng/ml的BDNF可有效地促进胆碱乙酰转移酶

免疫反应性运动神经元的存活[14]

。GDNF不仅促进正常运动神经元的存活、降低细胞凋亡中自然发生的神经元死亡，还对受损的运动神经元具有营养保护作用。GDNF的神经营养保护作用比BDNF高75倍，比CTNF高650倍，是目前发现的活性最强的运动神经元神经营养因子。Mohajen等发现GDNF还能促进运动神经元存活和生长[15]。Storkebaum[16]将基因重组的VEGF经脑室内注入到ALS大鼠体内，发现治疗鼠的发病时间和生存期分别延长17d和22d。但对人类ALS的治疗试验尚在进行中，需进步观察其疗效和副作用。

3.2 抗凋亡的基因治疗

细胞凋亡是ALS等的标志之一。对进行性运动神经元病（PMN）的模型，转入表达抗凋亡的Bcl-2或胶质细胞源性的神经营养因子基因可预防运动神经元的凋亡，但对动物的生存期没有影响。Anna等研究者[17]将PMN小鼠与带显性突变Wlds基因的小鼠杂交，产生的PMN/Wlds鼠状和生存期较PMN小鼠有一定程度改善，推测可能与Wlds基因产物减轻PMN小鼠逆向转运缺陷有关。

3.3 RNA抑制基因表达的治疗

20xx年出现的RNA干扰技术（RNA

interference,RNAi）,又称基因沉默技术，是通过破坏细胞源性mRNA来阻止相应基因表达，保护细胞免受病毒和其它遗传因子的影响。Maxwell等[18] 的研究提示,在体外培养的小鼠成神经细胞瘤细胞 中稳定表达的人突 变SOD1使细胞对细胞毒的刺激( 环胞菌素- A) 很敏感，当用RNAi特异性减少突变SOD1表达时，可有效对抗环孢素-A引起的细胞死亡。Ralph和Raoul等[19、20]利用设计的一种慢病毒载体携带特异性抑制突变SOD1的RNAi，并将其注入ALS模型鼠的肌肉或脊髓内。检测证实动物体内突变SOD1的表达显著减少，脑干和脊髓中运动神经元的存活率明显提高，同时可以有效的提高ALS模型鼠的运动能力以及延长其寿命。

Xie等的研究结果提示，靶向抑制前列腺凋亡反应基因4（Par-4）可能对变性运动神经元具有神经保护作用。Par-4来自脊髓前角的突触小体和后突触致密区，可能是导致运动神经元变性的级联事件中的一个关键性环节。利用RNAi技术降低Par-1表达，可减低由突变SOD1引起的突触小体处caspase-3活性和线粒体障碍，从而减缓神经元变性的发展。

3.4 其它

最近发现ALS患者有编码神经丝重链(NF-H)的基因突变，因此利用腺病毒载体介导人类神经丝轻链(NF —L) 基因可以治疗过度表达NF- H鼠，其发病和生存期平均延长了6周左右。由于神经丝轻链对神经丝重链介导 的ALS发病有保护作用，故推测其也可能具有一定的治疗作用[21]。

Jiming认为如果NF水平增加出现在神经元的胞体内而不是轴突等处， 可缓解ALS。并推测N F蛋白能减低运 动神经元中突变SOD1蛋白的毒性，原因可能是大量NF蛋白形成了一个有效

的蛋白池来吸收氧自由基等毒性物质， 的发病机制、阐明疾病的病理生理过而避免后者对其他细胞器的损伤。 程和开发药物治疗新靶点提供线索，

从而解决ALS在诊疗方面所带来的诸4 结论 多困惑。近年来，尽管基因治疗方法

由于ALS发病机制可能涉及突变的基础研究取得了一定成绩，但离临SOD1的“获得毒性”、兴奋性氨基酸毒床应用还有很大距离。当前，ALS的临性、线粒体障碍、轴突运输障碍、氧床治疗应以提高其生存率，缓解其痛化损伤及细胞凋亡等方式，因此有效苦为标准，不断提高基因诊疗技术，的ALS治疗策略应尽可能的兼顾多方使ALS患者得到早期诊断、早期治疗，面，且将副作用减到最低限度。从理延长患者寿命，提高患者生活质量，论上讲，致病基因的分析能够为我们尽可能治愈ALS。

进一步认识疾病的病因学、摸清疾病

5.参考文献

1. Kunst C B.Complex genetics of amyotrophic laterl scerosis [J].Am J Hum Gener,2004,75:933.

2. Voterra A ,Trotti D,Tromba C,ct al.Glutamate uptaker inhibition by oxygen free radial in rat cortical astrocytes[J].JNeurosic,1994,14(5)：2924.

3. 樊东升，张俊，邓敏，等．肌萎侧索硬化/运动神经元病的基础与临床研究[ J ] .北京大学学报，2 0 0 9 ，41(3):279．

4. 史树贵，李露斯、 陈康宁,等．一个肌萎缩侧索硬化家系SOD1基因突变的发现 [ J ] ．中华医学遗传学杂志 、 2004,2I(2)：149一t52．

5. Rosen DR,Siddque T,Patterson D,et al.Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis[J].Nature,1993,362(1):59-62.

6. Cookson MR,Menzies FM,Manning P,et al.Cu/Zn superoxide dismutase(SOD1) mutation associated with familial amyotrophic lateral sclerosis(ALS) affect celluar free radical release in the presence of oxidative stress[J].Amyotroph lateral Scler Other Motor Neuron Disord,2002,3(1):75-85.

7. Szczudlik A,Tomik B,Slowik A,et al.Assessment of the efficacy of treatment with pimozide in patients with amyotrophic lateral sclerosis.Introductory notes[J].neurol Neurochir Pol,1998,32(4)：821-829.

8. Mitsumoto H,Ikeda K,Holmlund T,et al.The effects of ciliary neurotrophic factor on motor dysfunction in wobbler mouse motor neuron disease[J].Ann Neurol,1994,36(2):142-148.

9. Al-Chalabi A,Scheffler MD,Smith BN,et al.Ciliary neurotrophic factor genotype dose not influence clinical phenotype in amyotrophic lateral sclerosis[J].Ann Neurol,2003,54(1):130-134.

10. Ilzecka J.Increase serum CNTF level in patients with amyotrophic

lateral sclerosis[J].Eur Cytokine Netw,2003,14(3):192-194.

11. Neff NT,Prevette D,Houenou LJ,et al.Insulin-like growth factors:putative muscle-derived trophic agents that promote motoneuron survival[J].J Neurobiol,1993,24(12):1578-1588.

12. Sakowski SA,Schuyler AD,Feldman EL.Insulin-like growth factor-1 for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis[J].Amyotroph Lateral Scler,2009,10(2):63-73.

13. Sorenson EJ,Windbank AJ,Mandrekar JN,et al.Subcutaneous IGF-1 is not beneficial in 2-year ALS trial[J].neurology,2008,71(22):1770-1775.

14. Derby ML,Giuliano R,Figlewicz DA,et al.GDNFis trophic for mouse motoneurons that express a mutant superoxide dismutase(SOD-1) gene[J].Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord,2000,1(2):113-122.

15. Yalin S,Bagis S,Polat G,et al.Is there a role of free oxygen radicals in primary male osteoporosis?[J].Clin Exp Rheumatol,2005,23(50:689-692.

16. Stokebaum E,Lambrechts D,Dewerchin M, et al.Treatment of motoneuron degeneration by intracerebroventricular delivery of VEGF in a rat model of ALS.Nat Neurosci ,2005,8(10:85-92.

17. Anna Ferri,Joshua RS,Michael PC,et al.Inhibiting axon degeneration and synapse loss attenuates apoptosis and disease progression in a mouse model of motoneuron disease.Current Biology,2003,13(8)：669-673.

18. Maxwell MM,Pasinnelli P,Kazantsev AG,et al.RNA interference-mediated silencing of mutant superoxide dismutase rescues cyclosporine A-induced death in cutured neuroblastoma cells.Proc Natl Acad Sic USA,2004,101(9):3178-3183.

19. Ralph GS,Radcliffe PA,Day DM,et al.Silencing mutant SOD1 using RNAi protects against neurodegeneration and extends survival in an ALS model.Nat Med,2005,11(4):429-433.

20. Raoul C, Abbas-Terki T ,Bensadoun JC,et al.Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS.Nat Med,2005,11(4):423-428.

21. 肖勒, 肌萎缩侧索硬化症治疗的研究进展[J].国外医学·神经病学疗中经外科学分册，2009,(4)：190.