大肠癌基因治疗
【摘要】: 大肠癌的基因治疗作为一种新的治疗手段，近年来倍受关注，其很多研究已进入临床阶段。大肠癌基因治疗的研究主要包括：自杀基因治疗、基因修复或置换治疗、反义基因治疗、免疫基因治疗及溶瘤病毒治疗等。此文就近期大肠癌的基因治疗研究结果和存在的问题作一综述。
【关键词】: RNA 干扰 大肠癌 基因治疗
1.RNAi在大肠癌基因治疗
1.1 癌基因沉默
研究表明[1] ,大肠癌的发生与野生型点突变形成的癌基因如p53 , k2ras 有关。RNAi 可以精确识别到一个核苷酸,运用RNAi 能准确有效的封闭突变的癌基因,而野生型基因则不受影响,用这种方法可以阻断某些突变基因的表达。Martinez等[2]报道,将H1299 细胞转染野生型p53 或突变型p53 的siRNA 表达型质粒,结果发现,野生型siRNA明显抑制野生型p53 蛋白表达,对突变型几乎无效; 而突变型siRNA 显著抑制突变型p53 蛋白表达,对野生型基因则不受影响。结果证明,siRNA 可以辨别野生型p53 及突变型p53 ,点突变靶向性siRNA 可以恢复野生型的活性,限制突变型蛋白的表达。
大肠癌的发生是多基因、多因素共同作用的结果,单个癌基因沉默效果并不好RNAi 技术的另一大优势在于能同时抑制多个不同基因,且抑制效果互不干扰
[3]。
1.2阻断与大肠癌转移相关的细胞因子
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF) 是一种相对分子质量为3. 4 ×104～4. 5 ×104 的糖蛋白,其作用主要是刺激血管内皮细胞增殖、迁移并形成新生的血管,这些新生血管是肿瘤组织生长的必备条件,同时也是肿瘤转移的基础。Takeda 等[4] 证实,VEGF 是大肠癌转移的重要调节因子之一。Takei等[5] 设计了针对人VEGF的siRNA ,采用体外合成的方法得到相应的siRNA ,直接注射到PC23 细胞建立的荷瘤鼠模型的肿块组织中。结果肿瘤组织中的VEGF 在mRNA 水平和蛋白水平的含量明显低于对照组,肿块体积亦明显小于对照组。Nagy等[6] 应用VEGF 同源蛋白构建可形成siRNA 质粒载体,发现其对肿瘤细胞的抑制作用明显。
1.3 RNAi在抑制端粒酶活性研究中的应用
端粒酶的活化使细胞具有无限增生的能力是恶性肿瘤的普遍现象。正常细胞不表达端粒酶而大多数肿瘤细胞中有端粒酶的表达。方向明等[7] 报道,大肠癌组织中端粒酶活性和端粒酶催化亚单位mRNA ( hTERT mRNA) 阳性检出率分别
80. 4 %和87. 0 % ,而相应正常大肠组织无一例检测到端粒酶活性或hTERTmRNA 表达; 大肠癌与正常组织端粒酶活性及hTERT mRNA 表达率比较差异均有统计学意义( P< 0. 01) 。此外,大肠癌组织hTERT mRNA 表达与端粒酶活性呈显著正相关。Horikawa 等[8]构建了端粒酶逆转录酶( hTERT) 和端粒酶RNA ( hTR) 的同源序列dsRNA 并转染各种肿瘤细胞系,结果发现,这2 种dsRNA都能使肿瘤细胞内的端粒酶活性有所降低,并且RNAi 对端粒酶表达的抑制作用具有浓度和时间的双重依赖性。从上述研究可以看出,端粒酶可作为肿瘤分子治疗的靶基因,通过siRNA 抑制端粒酶活性在大肠癌的基因治疗中有广阔前景。
2. 免疫基因治疗
免疫基因治疗又叫细胞因子基因治疗，是肿瘤治疗策略中研究得最多，也
是最具有临床应用潜力的基因治疗策略之一。选择编码细胞因子或其受体为目的基因，将其导人肿瘤细胞或免疫效应细胞，再将转染细胞回输肿瘤患者体内，这些转染细胞将在肿瘤局部产生高分泌量的细胞因子，利用其来杀伤肿瘤细胞，使肿瘤的生长受到抑制或坏死消退，达到抗肿瘤的目的。大量的细胞因子一方面增强肿瘤的免疫原性，诱导宿主产生免疫反应；另一方面局部高浓度的细胞因子本身对肿瘤细胞发挥直接的毒性作用，同时避免了因全身使用这些细胞因子而带来的严重毒副作用。大肠癌的免疫基因治疗主要是输入细胞因子基因及肿瘤相关抗原基因重组的病毒基因，目前主要有以下方法[9.10]
2．1 细胞因子基因直接注射 常用的是将IL-2重组到腺病毒载体中，然后直接 注射到肿瘤瘤体内或腹腔内，腺病毒有引发机体免疫反应的特点和可以在治疗初 期高水平表达转移基因等优点，研究未发现严重毒副反应。
2．2 细胞因子基因导人免疫效应细胞如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIE)和巨噬细胞等，以提高它们的抗肿瘤活性。目前因转基因免疫活性细胞在体内靶向性差，存活时间短而较少用于大肠癌的基因治疗。
2． 3 制备细胞因子导人的肿瘤疫苗细胞因子导人肿瘤疫苗是近年来肿瘤免疫治疗的又一个热点，可以将共刺激因子、肿瘤特异性抗原或细胞因子基因导入肿瘤细胞中制成新型疫苗，经放射线照射灭活等处理后再输回患者体内，能打破免疫系统对肿瘤的耐受，诱导宿主免疫反应[11.12]。研究还发现共刺激因子与肿瘤特异性抗原联合应用，有放大肿瘤疫苗免疫原性的作用，从而更高效地杀灭肿瘤细胞。将基因导人肿瘤细胞制成新型疫苗，目前存在着一些理论和技术的问题难以解决，使其应用受到限制[13]。
3 .针对癌基因和抑癌基因的治疗
在分子研究水平上发现肿瘤的发生与原癌基因被激活转变为癌基因和一些抑癌基因的失活有关。当前发现与大肠癌密切相关的原癌基因主要有P53、MCC、APC、DCC、PI6、BCL-2、MADR2等，其中P53基因研究的最多。现在普遍认为有5％的大肠癌患者存在P53基因的变异。基因治疗通过同源重组的方法在P53基因缺失或突变的肠癌细胞中导入有功能的野生型P53基因，从而使肿瘤细胞丧失恶性表型或发生凋亡。研究还发现野生型P53基因可下调血管内皮生长因(VEGF)mRNA的表达，从而抑制结肠血管肿瘤生成，减缓肿瘤生长[14]。抑制癌基因的表达采取的是反义抑制策略，即是用反义寡核苷酸或核酶选择地抑制癌基因或致癌病毒基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长。这是在mRNA水平上特异地封闭癌基因来达到抑制肿瘤细胞的发生与发展的目的，是一项很有潜在价值的肿瘤
治疗手段[15]。
4. 抗肿瘤血管生成的基因治疗
肿瘤的生长与转移离不开血液供应，于是人们设想通过抗肿瘤血管生成来达到抑制肿瘤生长的目的。具体的研究方向包括两个方面。一是抑制促血管生成的生长因子及其受体，采用的技术包括反义核酸技术，导入P53抑癌基因等；二是抗血管生成介质转移，最近发现的BA1l基因经在大肠癌患者中研究证实，其具有抑制肿瘤新生血管的作用，从而抑制肿瘤的生长[16.17]。抗肿瘤生成基因治疗可在肿瘤局部长期持续表达抗血管生成基因产物，可以不受到肿瘤周期的影响，故是放、化疗及其他基因治疗方案的良好补充，但仍有不少问题有待解决，目前还停留在体外和动物实验阶段。
5. 改善肿瘤化疗疗效的基因治疗
这可通过在造血干细胞中导入耐药基因来实现，使正常造血干细胞能耐受大剂量化疗药物，从而保护干细胞，在不造成白细胞或血小板下降的同时，最大限度地杀灭肿瘤细胞。例如已开展研究的有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因和MDRL基因，其中MDRL基因的表达可以造成对多种化疗药物的耐药[18]。但是这些方案还存在着一些问题，诸如干细胞的转移效率低和耐药基因转移给肿瘤细胞带来的危险等。
6. 联合治疗
实验表明，联合应用多种基因或多种疗法比单一基因或疗法能更有效地杀伤肿瘤细胞，联合治疗是目前基因治疗的发展方向[19]。目前应用于大肠癌的联合基因治疗主要有：(1)自杀基因前药系统的联合如CD／5．FC和GCV／HSV．TK的联合应用．可使杀灭肿瘤所需的5-FC和GCV最低浓度下降50％以上。(2)自杀基因与细胞因子的联合应用，常用的有TK基因与IL-2的联合应用，已有动物实验证明其可避免肿瘤的复发，延长动物的成活时间。(3)自杀基因与放、化疗的联合应用， 5可提高肿瘤细胞对放、化疗的敏感性[20]。(4)多种细胞因子基因联合应用。常见的有IL-2+IL．12、IL-12+TNF、IL-12+IFN、IL．2+TNF+MHC—I等。
【问题与展望】
2001 年《Nature》杂志首先报道在哺乳动物培养细胞中通过siRNA 成功诱导了靶基因表达沉默后,RNAi 技术就成为一项特异性的基因沉默工具广泛运用于分子生物领域。小RNA (MicroRNA ,miRNA) 的作用与应用研究在2001 、2002 连续两年被美国《Science》杂志评选为年度10 大突破技术。RNAi 为抗肿瘤的基因治疗提供了强有力的工具,为人类攻克大肠癌带来了新的希望。目前RNAi 的作用机理尚未完全清楚,针对哺乳动物细胞的siRNA 设计和筛选有一定盲目性,构建高效稳定的表达载体尚在探索之中,大部分工作还处于基础研究状态。但是RNAi 高度的特异性以及技术流程简便、短周期,在细胞内表达的稳定性、可传递性、高效性等优势已经使这一技术在肿瘤的基因治疗方面显示出诱人的前景。总之,在组织细胞学、分子生物学等基础学科不断发展的基础上,随着RNAi 理论和技术的不断进步,RANi 用于基因功能及大肠癌基因治疗的研究将有更广阔的前景。
大肠癌的基因治疗研究绝大多数仍处于实验阶段，少数进入人体的研究亦无成熟的系统方案，要想使基因治疗成为常规的治疗方案，应该解决如下问题。
1. 特异性 目前仍未发现大肠癌的特异性标志物和特异性表达基因，因此，找大肠癌特异性启动因子并将其作为特异性治疗靶子是提高大肠癌基因治疗的键。
2. 技术性 有关大肠癌治疗的基因工程技术并不完全成熟，基因转导低效，特异产物对肿瘤的疗效亦比预期低，基因转导的靶向性亦需改善。
3. 安全性非损伤性基因表达的监 。控亦需注意问题。
总之，现有的基因治疗方案还不能完全满足需要，存在着种种理论和技术上的问题，其中最关键的是基因转移的技术手 段还不够理想，基因转导的低效性和转导产物抗肿瘤的低效性使基因治疗的特异性和杀伤活性还达不到治愈肿瘤的求。当前倾向于寻找针对某一肿瘤的特异性启动子来提高基因治疗的特异性，而在提高基因治疗的杀伤活性方面，正在研究的课题是联合应用基因治疗，使形成叠加效应。基因表达的安全性和基因载体的安全性亦是令人关注的问题。费用昂贵也限制基因治疗的研究和应用。随着基因治疗 ．技术的不断进步，我们期待在不久的将来，基因治疗将会成为肿瘤治疗的又一常规手段。
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