生命科学发展趋势与现代生物技术进展综述
摘要: 生命科学是当代发展最快, 最为活跃的领域之一, 生命科学将成为21世纪自然科学的带头科学, 其中分子生物学已成为现代生物学的前沿学科和带头学科,分子生物学对生物学的各学科如遗传学, 细胞生物学, 神经生物学, 生殖生物学, 生理学, 发育生物学等均产生了深远的影响。以重组DNA技术和细胞融合技术为标志的现代生物技术的产生和发展在分子水平和基因水平上改良生物的遗传性状和创造新的物种取得了一定的进展。现代生物技术已在基因工程医药生产, 基因治疗, 转基因植物和转基因动物等方面展现出很大的发展潜力。
关键词: 分子生物学；分子杂交；DNA重组技术；分子克隆技术；PCR技术；生物芯片
20世纪后叶，生命科学的各领域取得了巨大的进展，特别是分子生物学取得了突破性成就，使生命科学在自然科学中的位置发生了革命性的变化。很多科学家认为在未来的自然科学中生命科学将要成为带头学科，预言下一世纪是生物学世纪。这种提法已为越来越多的人所接受。在未来的21 世纪生命科学将蓬勃发展，生命科学对自然科学将起到巨大的推动作用。
1 生命科学的主要发展趋势
分子生物学, 遗传学, 细胞生物学, 神经生物学和生态学是当前生命科学的基础学科, 这些学科较为活跃, 进展较快, 它们反映了现代生命科学的总趋势。分子生物学在生命科学中的主流地位以及它在推动整个生命科学发展中所起的巨大作用是无可争辩的；遗传学在将来仍保持它在生命科学中的核心作用；细胞生物学作为生命科学的基础学科地位必须重视；发育生物学将成为21世纪生命科学的“新主人”，这种预测已逐渐变成现实；神经生物学的崛起将代表生命科学
的下一个高峰；生态学可能是最直接为人类生存环境服务,并对国民经济持续与协调发展起重要作用的学科。
2 分子生物学概述
分子生物学是在分子水平上研究生命现象本质与规律的科学。分子生物学的核心是遗传信息，也就是从DNA到RNA，再到蛋白质的信息传递的过程，称为遗传信息传递的“中心法则”。各种生物的基因组结构，生物基因表达过程在各层次上的调控已成为分子生物学研究的主要领域。
分子生物学研究表明生物具有高度的一致性，生命的多样性和生命本质的一致性，是一个辩证的统一虽然生命现象在数量繁多的不同种属中的表现形式是多种多样的，但是生命活动的本质在不同的生物体中，却是高度一致的。各种生物具有相似的遗传物质，类似的基因结构和表达与调控的机理，具有一致的三联密码，遵循一致的信息流中心法则，具有一致的细胞周期等等。假如没有这样的一致性，也就不可能把一个基因从一个生物体转移到另一个生物体，得到表达并发挥相同的作用。这个转移就是建立在三联密码的高度一致性的基础上。分子生物学的发展，对生物学的各个学科产生很大的影响，分子生物学在生命科学中的主导作用将要持续下去。
3 现代分子生物技术的进展
现代分子生物技术也可称之为生物工程， 是以重组DNA技术和细胞融合技术为基础，利用生物体(或者生物组织、细胞及其组分)的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，以及与工程原理相结合进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。其内容包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程。
3.1 分子杂交
杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法,多使用甾类化合物地高辛配基（digoxigenin，DIG）标记。
核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序 1
列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。
3.1.1核酸分子杂交原理
DNA分子是由两条单链形成的双股螺旋结构，维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，DNA分子成为单链，这一过程称作变性或融解。加热、改变DNA融解的pH值，或有机溶剂等理化因素，均可使DNA变性。变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外光吸收增加。在温度升高引起的DNA变性过程中，DNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的重点被称作融解温度Tm。Tm值得大小取决于核酸分子的G-C含量，核酸分子的G-C含量越高，其Tm值越高。因为G-C碱基之间有三个氢键，而A-T碱基之间只有两个氢键。变性DNA只要消除变性条件，具有碱基互补的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称作复性。根据这一原理，将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构，这一过程称作杂交（hybridization）。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就可以形成杂交体
3.1.2分子杂交的应用
Southern印记杂交
1、单基因遗传病的基因诊断：早在19xx年，简悦威等医学家在镰状细胞贫血症的基因诊断中就采用过Southern杂交的方法，取得了基因诊断的突破。
2、基因点突变的检测：例如ATP敏感性钾离子通道的亚单位内向整流钾通道基因A635G突变的检测
Northern印记杂交 ：
Northern印记技术多用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录以及转录的相对水平。目前，Northern印记技术仍然被认为是检测基因表达水平的金标准。
液相杂交 ：
以液相杂交技术为基本工作原理设计的多功能悬浮点阵仪是液态芯片技术应用的典范。这一技术平台已被应用于遗传突变的分子诊断，如出生缺陷干预工程中的Down’s综合征、珠蛋白合成障碍性贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷的基因诊断，也已被用于SNPs分析、感染性疾病的鉴别诊断、药物敏感性和亲子鉴定。此外，还可以应用于基因表达谱的分析，从而进行肿瘤性疾病如血液病、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、膀胱癌和结肠癌的分子病理学研究。
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荧光原位杂交(FISH)技术
1、细胞遗传学分析：
①产前诊断：在新生儿的先天性疾病中，染色体的数目异常要占很大的一部分，其中以染色体X、Y、13、18和21数量的异常最为多见。利用FISH技术的优势还可以用于产前诊断中的羊水细胞核型分析。常规的染色体型分析技术需要对羊水细胞进行培养，时间较长。FISH技术可以在少量的羊水细胞涂片上进行异常染色体的数目分析，不需要羊水细胞的培养，记得地缩短了病人等待的时间。
②生殖医学中的应用：采用FISH技术可对一个卵裂球的染色体进行检测，排除存在染色体异常的胚胎，提高胚胎种植成功率。另一方面，对精子染色体的研究已经成为男性不育者精子检测的一项重要内容。
③血液疾病中染色体易位的检测：在化疗后缓解的慢性粒细胞性白血病病人的标本中，采用FISH技术极易发现残存的白血病细胞，确定微小残留病灶。FISH检测的结果对白血病的诊断、治疗和预后的估计提供了有力的依据，也为白血病机制的研究提供了线索。
2、 病原学检测：采用FISH技术还可以快速鉴定血培养中的微生物、送检样本中的病毒等，采用诊断微生物DNA或RNA的荧光标记探针可以直接快速地检测出微生物病原体核酸，检测灵敏度较高。
3、比较基因组杂交;
4、基因图谱绘制;
5、诊断微生物菌落结构与群落动态;
6、监测微生物的原位生理学;
7、FISH技术结合流式细胞术定量化检测微生物。
3.2 DNA重组技术（又称基因工程)
这是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段(如某个基因或基因的一部分)按照人们的设计定向连接起来， 在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达， 产生影响受体细胞的新的遗传性状。严格地说，D NA 重组技术并不完全等于基因工程， 因为后者还包括其他可能使生物细胞基因组结构得到改造的体系，DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深人研究的结晶，而限制性内切酶、DNA连接酶及其他工具酶的发现与应用则是这一技术得以建立的关键。
3．2．1 DNA重组技术的原理
19xx年，美国生物化学家可恩和博耶首先创立DNA重组技术。20世纪80 年 3
代后，这项技术进人实用阶段。DNA重组技术就是将不同来源的DNA片段连接起来，构造新的基因型的过程。通常采用目的基因和质粒载体相连接的方法。它的基本过程是: 首先，合成或利用其他方法获得所需的基因，再用内切割酶切取所需基因片段；其次，选择合适的基因载体与上述基因片段结合，借助DNA连接酶联结，重组DNA；再次，选择安全而有效的受体细胞，将组装好的DNA装配到受体细胞内一般是用大肠杆菌、酵母菌等生命力强，表达基因性能好的细菌。这样，每个细胞就像一座小型工厂那样，源源不断地制造出人类所需的产品。
3．1．2 DNA重组技术的应用
DNA重组技术有着广阔的应用前景。首先，它可被用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肤，如激素、抗生素、酶类及抗体等，提高产量，降低成本， 使许多有价值的多肤类物质得到广泛应用。如美国科学家最近发现的用于治疗艾滋病的基因工程白细胞元素12(IL- 12)，可有效地阻止病情发展，恢复HIV病毒携带者的免疫系统和功能；由转基因烟草产生的α—栝楼素(trichosanthin)也被用于抑制HIV的生长。
其次，DNA 重组技术可用于定向改造某些生物基因组结构，使它们所具备的特殊经济价值或功能得以成百上千倍地提高。如有一种含有分解各种石油成分的重组DNA的超级细菌，能快速分解石油，可用来恢复被石油污架的海域或土壤。美国科学家应用该技术构建了“工程沙门氏菌”，在研制避孕菌苗方面取得了重要进展。他们先去掉沙门氏菌致病基因部分，再引人来自精子的某些遗传信息， 将改造后的细菌送人雌鼠体内，发现能产生排斥精细胞的抗体，使精子不能与卵子结合， 从而达到避孕目的。预计这种新型避孕菌苗将在今后几年内投放市场。 此外，设在波士顿的美国陆军研究发展和工程中心还从织网蜘蛛中分离出合成蜘蛛丝的基因，并利用该基因在实验室里生产蜘蛛丝。他们将这一基因转移到细菌内，生产出一种可溶性丝蛋白，经浓缩后形成一种强度超过钢的特殊纤维。研究人员希望对该基因进行修饰，以生产出高性能纤维，从而用于生产防弹背心、帽子、降落伞绳索和其他高强度的轻型装备。
3.3 分子克隆技术
克隆(clone， clon)一词源于希腊文Klon，原意为树木的枝条。在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体， 在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状， 常称无性繁殖(细胞) 系； 其动词(clone，cloned )含义指在生物体外用重组技术将特定基因插人载体分子中，即分子克隆技术。
3．3．1 分子克隆技术的原理
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分子克隆技术是一种在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA 片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插人克隆载体，形成重组克隆载体， 通过转化与转导的方式，引人适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插人DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。
将DNA片段(或基因)与载体DNA 分子共价连接，然后引人寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。DNA克隆是以mRNA 为原材料，经体外反转录合成互补的DNA (cDNA )，再与载体DNA 分子连接引人寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。
3．3．2 分子克隆技术的应用
分子克隆技术是20世纪70年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。 它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响， 并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。
在医学方面，利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松驰素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。
在基因治疗方面， 通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性， 例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的入噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖昔酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。
在工业生产方面，以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系，常综合利用。许多化学试剂如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水杨酸等都可能利用分子克隆技术得到产品。在环境保护方面，人们根据需要进行基因操作，将某种微生物的基因转人另一微生物， 创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解工业污水中的有毒物质。在食品工业方面，细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖类等。在农业生产方面，植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导人植物获得了成功。
3.4 PCR 技术
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ， 简称PCR ) 技术诞生于1985 5
年，它是根据生物体内DNA复制的某些特点而设计的在体外对待定DNA序列进行快速扩增的一项新技术。随着热稳定性Taq DNA聚合酶的应用和自动化热循环仪的设计成功，PCR技术的操作程序大大简化，并且很快在世界各国被广泛地应用于基因研究的各个领域。它对分子生物学及其相关学科的基础研究和诊断应用等方面正产生着革命性的影响。PCR技术的发明者，美国Cetus公司人类遗传室的Kary Mulis，因此而与开创了“ 寡核苷酸基因定点诱变”方法的加拿大籍英国科学家Michael Smith 共获1993 年度诺贝尔化学奖171。PCR 技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。
3．4．1 PCR 技术的基本原理
PCR技术的基本原理类似于D NA 的天然复制过程， 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核昔酸引物。PCR 由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。
1) 模板DNA的变性: 模板DNA 经加热至93℃ 左右一定时间后，使模板
D N A 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮的反应做准备；
2) 模板DNA与引物的退火(复性): 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至5 ℃ 左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；
3) 引物的延伸: DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性—退火—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2-4 min，2-3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
3．4．2 PCR 技术的应用
PCR 技术自19xx年建立以来，发展之迅速、应用之广泛，表明其具有强大的生命力。近些年来，基于PCR的基本原理，许多学者充分发挥创造性思维，对PCR 技术进行研究和改进，使PCR技术得到了进一步地完善，并在此基础上派生出了许多新的用途。
1 )原位PCR 技术原位PCR 就是在组织细胞里进行PCR 反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR 技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。原位PCR是Hasse等于19xx年建立的，原位PCR 既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内 6
的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。其特异性和敏感性高于一般的PCR。
2 )连接酶链反应
连接酶链反应(Ligase chain reaction ，LCR )，是一种新的DNA体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。
连接酶链反应是Backman l997年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明， 并申报了专利。LCR的基本原理为利用DNA连接酶。特异地将双链DNA片段连接，经变性--退火--连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增。
LCR 的扩增效率与PCR 相当，用耐热连接酶做LCR 只用两个温度循环，94 ℃ 变性和65 ℃ 复性并连接，循环30次左右。其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等。
目前，还有许多新的PCR 技术包括:依赖核酸序列的扩增技术，转录依赖的扩增系统技术，哪复制酶反应技术，标记PCR和彩色PCR技术，反向PCR技术以及重组PCR技术等。
3.5 生物芯片
生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。
3．5．1生物芯片基本原理
荧光标记和检测是利用荧光标记的DNA碱基在不同的波长下吸收和发射光。在微阵列分析中，多色荧光标记可以在一个分析中同时对二个或多个生物样品进行多重分析，多重分析能大大地增加基因表达和突变检测结果的准确性，排除芯片与芯片间的人为因素。荧光为基础的分析使得利用一些先进的数据获得技术成为可能，包括共聚焦扫描的CCD照相技术。用于芯片制备的无孔基质表面使得芯片检测中的生化反应大大受益。玻璃基质所需的反应体积（5-200ul）比传统的分析要小的多（5-50ml），小反应体积降低了试剂的消耗，增加了微阵列分析中核酸的反应物的浓度（0.1-1um），相对于传统分析（0.1-4pm）增加100000倍之多，浓度的增加又能加速杂交的速度，从而减少获得强荧光信号的时间，并可用盖玻片封闭杂交槽进行杂交反应。对于以核酸杂交为原理的检测技术，主要 7
过程为：首先用生物素标记经扩增（也可使用其它放大技术）的靶序列或样品然后再与芯片上的大量探针进行杂交。用链霉亲和素（streptavidin）偶联的荧光素（常用的荧光素还有lassamine和phycoerythrin）作为显色物质，图象的分析则用落谢荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或其它荧光显微装置对片基扫描，由计算机收集荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。由于完全正常的 Watson-Crick配对双链要比具有错配（mismatch）碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性，所以，前者的荧光强度要比后者强出5-35%。从这一点来说，该检测方法是具有一定特异性的，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。
3．5．2生物芯片应用
对来源于不同个体（正常人与患者）、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导、不同治疗阶段）下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交，可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。所以，无论何种研究领域，利用表达谱基因芯片可以获得大量与研究领域相关的基因，使研究更具目的性和系统性，同时也拓宽研究领域。
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