RNA干扰的研究进展

姓名：** 班级：临床0911班 学号：**

摘要： RNA干扰是由双链RNA 介导，在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的新基因阻断技术,在基因功能研究、基因治疗方面已显示出巨大的前景，同时，RNAi 的分子机制研究也不断取得进展。本文阐述了RNA 干扰机制、特点、实现方法及应用。研究RNAi将有利于为人类肿瘤及难治性疾病的基因治疗提供重要理论依据和有力工具。

关键词：RNA干扰；基因；研究进展

RNAi指将与内源性mRNA 互补的dsRNA导入细胞后，引起该mRNA 特异性的降解，导致mRNA 编码的基因不能表达，发生基因沉默[1]。RNAi现象只是在20世纪90 年代以来才被认识并逐渐引起人们的注意，随后得以迅速发展，是当今以后基因组学的一个热门研究领域。

1 RNAi的机制

RNA i是将内源性mRNA 互补的dsRNA 导入细胞后, 引起该mRNA 特异性的降解, 导致mRNA 编码的基因不能表达, 发生基因沉默[3]。RNA i的作用机制被认为包括起始阶段、效应阶段、扩增和扩散阶段。起始阶段是较长dsRNA 在ATP 参与下被RNase 样的特异核酸酶切割加工成21~ 23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA。效应阶段是siRNA 在ATP参与下被RNA 解旋酶解旋成单链, 并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体。扩增和扩散阶段是指siRNA 不仅可引导R ISC切割靶RNA, 而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶作用下以靶mRNA 为模板合成新的dsRNA[3]。

2 RNAi的特点

2.1 高效性

注入细胞内的siRNA 的量比细胞内的mRNA 量要少得多。但因为其自身的循环放大机制仍可对目的基因产生有效地阻断[2]。

2.2 高特异性

单个碱基的改变即可以使RNAi失效，RNAi 能特异性降解mRNA，针对同源基因共有序列的RNAi则可使同源基因全部失活[3]。

2.3 共抑制性

外源基因可以转录，但不能正常积累mRNA 。RNAi作用不仅使外源基因在转录后水平上失活，同时诱导与其同源的内源基因沉默[3、4]。

2.4 种属时效性

Irie 等发现在低等生物中R N A i 可持续存在，但R N A i 在哺乳动物细胞中只能维持一段时间，一般注入dsRNA 后的2~3d，RNAi的作用最明显，而后1~2d 内，靶m R N A 的丰度就能恢复到dsRNA注射之前的水平[3]。

3 RNAi的实现方法

3.1 化学合成法[5]

该方法产物非常纯，但价格极为昂贵，一般的实验室无法承受，但最大的优点是研究人员不需要自己操作，将目的序列提交给公司订购即可。

3.2 体外转录法[5]

该方法的成本较低，而且合成速度也非常快，24h 左右即可完成。其原理是分别合成互补的两条带T7启动子DNA 模板，各自在体外转录为单链RNA，最后再将两条RNA链退火后形成双链RNA。

3.3 酶消化法[5]

有人根据siMA 形成的原理，利用细胞内形成siRNA 的关键酶Dicer来改进选取方法。首先是合成全长的目的基因的双链RNA，然后在体外用Dicer 酶消化，再将该混合物转染至细胞，可以得到非常高的抑制效率。

3.4细胞内表达法[6]

体内合成依赖于细胞内的转录过程,在细胞内转染进DNA片段，通过不同的启动子，在细胞内产生小发夹样的shRNA , 可产生与siRNA 同样的效果，可免除实验条件操作严格。

4 RNAi的应用

4.1 RNAi 在抗HIV 和SARS 病毒中的应用

RNAi 介导的抗病毒效应具有高度的特异性，对非同源基因表达没有影响。RNAi能高效抑制病毒复制，病毒在siRNA 作用的特定区域发生突变，仍可对另一不同区域重新设计siRNA，或测定该病毒的基因序列，更新相应的siRNA ，从而使RNAi 恢复对病毒的抑制效果,使之被持久抑制[2]。

4.2 RNAi 在抗肿瘤研究中的应用

肿瘤的一重要特征是细胞增殖与凋亡的异常，RNAi体内外研究已显示了RNAi在癌症治疗方面良好的应用前景，多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNA引发RNAi ，使癌基因或突变基因沉寂关闭[7]。

4.3 RNAi 在药物研究中的应用

在临床前药物开发中，获得了许多重要的候选药靶和化合物。然而，成功率并没有得到改善，上市时间也没有缩短。siRNA 技术能够满足这种需要，并已开始应用于药物作用的特异性和机制的研究，这有助于更早地鉴定较好的候选药物，加快药物的研制速度[2、6]。

4.4 RNAi 遗传学研究的应用[2、7]

4.4.1 稳定转座子：RNAi 缺陷可引起内源性转座子的移动。转座子的重要特征之一是具有反向重复序列，生物体通过此序列可以产生dsRNA 发夹，启动PTGS 效应，所以抑制转座子的移动有利于遗传稳定，防止遗传损害。

4.4.2 基因功能：分析人类基因组计划中的基因测序已经完成，人类将进入后基因组时代。其主要任务是确定基因的功能，因此迫切需要建立有效、经济的分析基因的技术。尽管目前对R N A i 机制并未完全弄清，但其高效特异阻断基因的表达已在某些研究中开展。

5 RNA的展望

RNA i在临床应用上有着独特之处, 它可以特异性地作用于某基因， 而没有明显的不良副作用[4、8]。但作为一个新技术, RNA i目前仍有以下几个关键问题需要解决: ( 1)siRNA 导入胞内的效率低下, 如何有效将siRNA转移入体内成为RNA i应用的最大障碍; ( 2) 目前RNA i机制尚未完全阐明, 尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多;( 3) siRNA的稳定性; ( 4) 在多基因家族中的非特异性问题等。但尽管目前的研究离真正应用还有一段距离,但作为一项极具潜力的新技术, 它将给生命科学带来新的期望。

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第二篇：生命科学研究进展--综述

益生菌和益生元在人体健康和食品营养领域的应用

（北京科技大学生物化学与分子生物学专业）

摘要： 益生菌在预防腹泻、增强乳糖耐受能力、调节免疫、预防癌症、降低胆固醇等方面具有很好功效。益生元通过促进肠内人体有益菌的繁殖，增殖体内有益菌，减少有害菌，优化菌群来平衡人体的健康。益生菌和益生元的复合制品即为合生元。合生元发挥作用的功效明显优于益生菌和益生元单独发挥的作用。本文主要综述了益生菌、益生元、合生元的定义、生理功能和在人体健康和食品工业中所起到的作用。最后讨论了合生元的发展前景。

关键词 ：益生菌；益生元；合生元；应用

Probiotics and prebiotics in application in the field of human health and food nutrition

Hao Ming-min

( the university of science and technology of Beijing, biochemistry and molecular biology)

Abstract: Probiotics has the very good effect on the prevention of diarrhea, enhancing the capacity of lactose tolerance, regulating immunity, preventing cancer, lower cholesterol, etc.Prebiotics can reduce the harmful bacteria and optimize the flora to balance the body's health by promoting good intestinal bacteria breeding,breeding bacteria in the body.The biostime is composite according to probiotics and prebiotics .Biostime is superior to the role of probiotics and prebiotics alone in efficacy.This article mainly summarized the definition of probiotics ,prebiotics and the biostime, physiological function,the role of the human health and the food industry .Finally it discussed the prospects of the development of probiotics.

Key words: probiotics;prebiotics;biostime;application

众所周知，抗生素自问世以来一直被用于疾病治疗和畜牧业生产中，对人类健康和社会发展起到了积极的作用。但是，随着致病微生物耐药性及破坏机体肠道内正常菌群等问题的出现，人们意识到抗生素作为一把双刃剑，在给人类带来健康的同时，也带来了一些潜在的危害。例如，抗生素的使用的一个意外后果是目标细菌之外的抗菌素耐药性的发展,如共生的细菌和人畜共患病原菌,如沙门氏菌和弯曲杆菌[1]。 而益生菌作为人体肠道中的正常菌群，在改善机体健康方面发挥了重要的作用。

1、益生菌

1.1 益生菌的概念 益生菌是指在机体肠道中达到一定的数量，能够对宿主产生直接的好处，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂，包括益生菌、益生元和合生元；狭义的益生菌则专指来源于宿主并对宿主健康有一定促进作用的活性微生物。

在益生菌种类中，最常见的是双歧杆菌和乳杆菌。此外，酿酒酵母和一些大肠杆菌及其他杆菌也被用作益生菌。常见的菌种包括长双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，这些菌种通常以混合制剂形式起作用[2]。

1.2 益生菌在人体健康方面的作用

在人体中微生物的数量大约是人体真核细胞的十倍。这些微生物在人体内保持着生态平衡，从而直接或间接地影响着我们的健康状态。饮食的平衡与我们的健康状态有密切的关系。在近些年，人类已经意识到肠道微生物在人体健康中的作用。尤其是在过敏症、炎症、新陈代谢衰弱等方面，肠道微生物都与它们的存在与否有关系在一些动物中的移植实验显示了肠道微生物转移的失衡是引起疾病的结果。可见肠道微生物保持生态稳定的重要性[3]。

当益生菌进入机体的肠道后，通过与肠道内其他微生物的一系列复杂的作用关系而达到促进机体保持健康的目的。益生菌主要的生理功能有以下几方面[4]：一、调节肠道菌群的平衡。在机体肠道内，各种不同的微生物通过复杂的关系来稳定机体的平衡，益生菌与一些致病菌相互竞争、拮抗而呈现动态的平衡。一旦这些菌群的数量失去平衡，机体将产生不适的症状。益生菌依靠产生的短链脂肪酸、过氧化氢及小分子肽来控制其他菌群在肠道内的数量来达到调节肠道微生物平衡的目的。二、免疫调节。益生菌存在于肠道内，可作为抗原促进人体产生多种抗体来增强人体免疫力。现有文献报道，益生菌甚至可以在胎儿出生前，通过血液循环进入胎盘，促进抗体的产生，对婴儿生长发育尤为有利。三、生物屏障作用。益生菌进入人体后，可与肠细胞特异或非特异性吸附，使外来病原菌无法在肠道内定植而保持极低数量， 而多数致病菌只有繁殖到一定数量才可以对人体产生毒害作用。四、营养吸收。人类膳食中存在很多人体本身无法吸收的物质，而这些纤维素、多糖和其他大分子物质可以被益生菌产生的多种酶类降解，为人体消化吸收。五、抗衰老、抗突变。益生菌能够产生过氧化氢酶，这种酶可以清除人体内的自由基，因此具有美容的效果[5]。

1.3 益生菌在食品营养方面的应用[6]

益生菌在干酪制品中的应用还是比较晚的。它已经被用于婴儿奶粉中，在未来可能发展到老年奶粉和孕妇奶粉的产品中。现在益生菌也被用于乳制品或果汁饮品中。将活性稳定的益生菌粉末固定到吸管中或者瓶盖上，在饮用前与饮料混合，既可以长的货架期又能获得活性益生菌。为了使益生菌能保持较长的活性，研究者使用了保护剂。用胶囊包住益生菌，在提供新颖的同时强化了益生菌的意识。在保健品市场方面，人们越来越重视活性益生菌的前景，随着微生态的研究，进一步发展益生菌保健产品将成为主导。

2、益生元

2.1 益生元的概念 益生元是一种可被选择性发酵且专一性地改变肠道中对宿主健康有益菌群的组成和活性的配料。事实上并不是所有膳食碳水化合物都是益生元。对这种分类应有一个科学标准，即这种食物成分应能抵抗胃酸哺乳类酶的消化水解并不被消化道所吸收，以保证大部分成分能进入大肠，而被肠道细菌群所发酵，特别是要能选择性地刺激有益健康的肠道细菌的生长和代谢活性[7]。

目前市场上应用到的益生元主要是低聚糖类、多糖类、天然植物提取物、蛋白质水解物、水解醇等。常见的如低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、棉籽糖、甘露低聚糖。这些功能性低聚糖在肠道内既不能水解，也不能被消化吸收，能选择性的刺激肠道中有益菌的生长和繁殖，使肠道菌群向有利于宿主健康方向转化[8]。

2.2 益生元在人体健康方面的作用

益生元在结肠功能的优化和代谢相关联。例如，一条短脂肪酸链组成的改变或表达的增加能增加机体粪便的重量，从而减轻腔的结肠内的pH值，最终减少氮含量产品和还原酶，增加结合蛋白的表达或生物一些领域的脂质和矿物质的新陈代谢，从而调节免疫系统。益生元主要的作用有一些几方面。一、在益生元中，例如FOS,TGOS等都是和它们共生的益生菌一起作用增加了双歧杆菌和乳酸菌而抑制了各种人类和动物病原细菌株如致病性的大肠杆菌，弧形杆菌，肠杆菌等。这些实验的证明是在小鼠、小猪、人体内进行的。此外，益生元的结合如葡聚糖和乳糖醇的结合影响了机体胃肠道的微生物系统，并且能增加IgA的分泌从而加强了免疫反应。二、益生元的免疫调节作用。功能性食品能增强消费者的免疫力。淋巴组织作为肠道免疫系统的一部分与饮食的组成和它们发酵的代谢产物有紧密的关系。虽然没有证据证明机体组织在表达免疫调节的过程中如何摄取益生元，但先天性防御能通过在宿主血浆细胞膜的受体上与多糖部分相互作用而被激活。三、益生元具有癌症的预防作用。益生元的发酵能产生短链脂肪酸从而对结肠粘膜产生影响。它们能直接或间接的影响肠上皮细胞的增殖，直肠内的炎症，致癌性，矿物质的可利用性和含氮化合物，酶激活，病原体的定植。四、益生元能影响脂代谢。益生元已经被证明在肝脏的脂类代谢中发挥着作用。菊粉和寡果聚糖能减少用餐后15％的胆甾醇血和50％的甘油三酯，从而降低机体胆固醇的含量。五、益生元能影响矿质元素的吸收。在青少年时期，每天摄入少量的益生元和长链的菊粉类的果聚糖能增加钙的吸收，增强骨盐沉积[9]。

2.3 益生元在食品营养方面的应用[10]

在乳制品行业，益生元可促进肠道内双歧杆菌的增殖，促进肠道微生态的平衡，提高肠蠕动动力，排除体内有毒有害物质。母乳中含有一种不能被消化的短链碳水化合物，它就是益生元，将益生元加入到婴儿食品配方中可以起到同样的效果[11]。

在饮料方面，益生元属于低聚糖，它可以调节饮料的渗透性，促进营养物质和水分的吸收。在酸性饮料中，低聚糖能够清理肠道，排除毒素，因此在各种饮料中得到广泛的应用。

在制酒行业，低聚糖麦芽糖可以用于酒类产品的发酵糖源，由于不能被微生物发酵利用，所以经陈酿可加工成营养甜酒保健品。在啤酒生产中添加低聚异麦芽糖可改善啤酒的品质，降低啤酒的酒精度，使其口味醇正。

在调味品行业，酱油的配料中加入低聚异麦芽糖，不仅能使酱香浓郁，咸味柔和，还能赋予其双歧因子很高的保质期。

在冷冻饮品行业，低聚糖浆热量低、价格便宜，具有香味，因此可用于生产冰淇淋。在保持甜度不变的情况下，减少配料中的蔗糖含量，可以降低产品的热量同时增加产品的功能性。低聚糖良好的保水性，有利于乳化，使产品膨胀、口感润滑。低聚糖可固定吸附乳品及香料中的香味物质，避免在加工过程中的挥发损失，保持了冰淇淋的风味。

3、合生元

3.1 合生元的概念[12]

合生元是食品组分选择性地结合益生菌而形成的微生物产品，它被定义为益生菌和益生元的混合物或一些有用的活细胞微生物（能在肠道中定殖）和选择性的底物。

3.2 合生元作用的机理

合生元的治疗作用通过益生菌和益生元的协作的形式影响着宿主。合生元通过选择性地增加健康的有益的细菌的增殖和代谢以及把活的微生物定殖到胃肠道区域。合生元得到发展的原因在于当益生元缺乏时，由于缺氧或不能适应的环境，较低的pH和，益生菌不能在消化系统中生存。另一方面，益生元是活细胞培养和生成的基本的防护层。在平衡的饮食方面，为了调节宿主抵抗感染和炎症的过程，合生元已经被广泛地用于大量流行性疾病的研究中，尤其是在传染性和炎症性疾病的临床治疗过程中，合生元对肠道菌群微生物的影响。它的调节机制主要有微生物区域的功能性质的调节，上皮细胞，树突状细胞和免疫细胞的调节[13]。

3.3 合生元的应用领域

在食品行业[14]，合生元被做成一种可食用的海藻酸钠的涂层，它用于制作奶酪表面涂层。研究发现，在货架期测试中，这种功能性食品的乳酸菌的活性保留较长的时间。此外，涂层中的合生元的添加产生了少量的抑菌作用，能够抑制假单胞菌、肠杆菌科从而提高了产品的最终口感并且延长了它的货架期。

在人体健康方面[15]，合生元混合治疗在治疗儿童急性腹泻起到了良好的效果。通过临床的研究发现，服用混合合生元（嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌、长双歧杆菌、粪肠球菌、低聚糖）后，急性腹泻的治疗效果以及疾病的持续时间都比不服用混合合生元的儿童的效果好。

4、合生元的应用前景

合生元在调节微生态平衡中的优势决定了它有很好的应用前景。随着全世界面临的人口老龄化问题，老年人的健康成为研究的热点，合生元在饮食上的调节对维护老年人的健康起着重要的作用。由于合生元在临床上应用的时间较短，它有许多问题需要去研究。例如益生菌在胃肠道的黏附能力的差异，益生元与益生菌协作的方式和剂量[16]。随着分子生物学的发展，人类对益生菌筛选、鉴定、作用机制会有很大的提高，通过与其他技术的结合生产出越来越多适用于人体的合生元产品。

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