生物样品稳定性考察的技术要求 默认分类 2010-06-09 23:58:08 阅读126 评论0 字号：大中小 订阅
从指导原则中我们可以理解样品稳定性包含了5个方面，但申报资料中往往只对其中的2～3项进行考察，应引起审评注意。
（1）冰冻稳定性（冷冻稳定性）：配制好数份低、中、高含药生物样品后冰冻，分别在数天或数十天时，取出化冻测定血药浓度，计算回收率来考察稳定性。冷冻稳定性（常规为－20℃）的目的是考察样品贮存的低温极限条件。因此所有样品分析必须满足一定时间内在特定的贮存温度下的稳定性要求。如有些样品冻存仅一周稳定，不能满足样品分析周期要求，可采用合适的方式延长冷冻稳定性，如采用超低温冰箱保存降低冰冻温度，也可采用加入适当的稳定剂，如含巯基化合物，添加抗氧化剂维生素C能大大延长冷冻稳定性。
（2）样品处理后的溶液中分析物的稳定性（测定溶液的稳定性）：含药生物样品于配制好后按“血浆样品的处理”项立即处理，置室温中分别在数小时或数十小时时测定，常将测定溶液放置在低温进样器中考察。该实验的目的是，考察在样品量大、分析批内待机时间长所致的待测样品发生的变化或仪器污染/疲劳/基线漂移等所造成的系统偏差。
HPLC法中如采用UV或FLD检测，可采用统计样品主峰面积RSD%考察。生物样本污染较大，当采用MS或MS/MS检测时，连续进样易污染加热毛细管，导致主峰面积逐渐下降，此时需要同时跟踪线性测定进行考察。也可考察降解杂质的变化来判断，如含奥美拉唑生物样品通过考察主要降解杂质磺酰化物，这种方法有时更为准确。
（3）冻融稳定性：配制好低、中、高含药生物样品，冻融数次（常3次）, 测定血药浓度，计算回收率来考察稳定性。由于生物样品分析复杂、误差大，易产生可疑数据，往往需要重新测定来确定数据的可信度，该稳定性为上述测定提供保证。如含赖诺普利血样，冷冻放置7天内基本稳定，冻融两次赖诺普利降解50％以上。解决冻融不稳定性的办法有：血样采集分离后，立即定量分成多份冷冻方式，满足实验要求。
（4）室温稳定性：配制好低、中、高含药生物样品后，在室温条件下放置数小时至数十小时后，按“血浆样品的处理”项立即处理测定，计算回收率来考察稳定性。该实验目的考察血浆样品处理过程中，待处理样品放置的合适条件。如文献报道，含尼莫地平血样在室温稳定性较差，需要冻融后立即处理测定，但这种情况会影响测定的效率，经室温稳定性考察后发现，在严格避光条件下，血样在24h内稳定。
（5）储备液的稳定性：对照品储备液分别置冰箱中（4℃）放置数天数十天后，取出后直接测定，测定方法可不同于含药生物样品的测定。如仅放置几天，可采用测定条件连续测定，计算样品主峰面积的RSD%来考察；如对照品容易获得，可采用新配制对照品溶液外标法计算储备液的含量来考察；对于昂贵的对照品（如代谢物）可采用HPLC归一化法联合吸收系数法来考察待测成分的变化。
生物等效性试验中样本保存及前处理应注意的几个问题 生物等效性试验中样本保存及前处理应注意的几个问题
生物等效性试验中样本保存及前处理应注意的几个问题
审评三部 李士敏 魏农农 赵明
【摘要】本文对生物等效性试验所用生物样本采集后到检测前在保存过程中应注意的几个方面的问题进行了阐述，希望能对从事此方面研究的人员有所帮助。
由于生物等效性试验的样本来源多为血样或尿样，所含的药物浓度较低，内源性干扰成分多，目标药物多与蛋白结合或呈缀合状态，在整个试验过程中，样本测定周期长，测试工作量大，因此其分析方法学的要求与一般的药物分析方法相比具有其自身的特点，我们在建立方法学时，应注重以下几个方面：
一、样品采集后的的处理和贮存
鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。
在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。血浆和血清都需要在采血后及时分离（24小时内），若不及时分离，血凝后再冰冻保存，则因冰冻时引起细胞溶解，阻碍血浆或血清的分出，同时因溶血而影响药物浓度变化。尿液主要是水、尿素及盐类，是很好的细菌生长液，因此应在取样后立即测定。不能立即测定时，应于4℃冷藏，如在室温保存，则应在采样后的尿液中加入少量防腐剂甲苯（1%）或氯仿（饱和）。生物样品中的一些不稳定的药物（如普鲁卡因、丙酸、红霉素、阿糖胞苷），易受血浆酯酶水解的影响，当采好样品之后应立即加入酯酶抑制剂氟化钠、三氯醋酸等，防制药物分解。易氧化的药物（如儿茶酚类、阿扑吗啡等）一般直接在-15℃ 仅能保存4周；若样品中加入维生素C或其他抗氧剂，则可稳定10周。生物样品在采样、贮存与分析过程中都应注意可能造成样品的损失或污染，以免将污染物作为药物新的代谢物。
二、生物样本贮存期间的稳定性考察
由于生物等效性试验样本从采样到检测的周期通常需要几周至几个月，在其贮存期间目标药物的稳定性需经考察验证。含药样本稳定性是指样品中的药物从采样至测定时性质和含量的稳定程度，它是贮存条件、药物的化学性质、空白生物样品和容器系统的函数，在特定的容器和生物样品中待测物的稳定性不能外推至其他系统。生物样本稳定性的评价应考察：
1、短期室温稳定性：要求高、低浓度样本在4~24 h内稳定。考察温度、光照、空气、酶解等因素。
2、长期低温条件下的稳定性：从第一个样本采集至最后一个样本的分析为一个考察时间周期，贮存温度一般为-20℃ ，如果需要也可在-70℃贮存。要求高、低浓度至少分别测定3次，测得结果与第一天测得的相应浓度比较应保持稳定。
3、冻融试验：取高、低浓度各3份于-20℃贮存24小时，取出后在室温自然解冻，取样测定，然后再将样品放回冷冻12~24小时，如此重复循环二次以上，分别比较各次测定结果。
4、对照液和内标液的稳定性：室温考察6小时稳定性，然后冷藏7~14天或恰当的周期后进行测定，与新配溶液的测定结果进行比较。
三、生物样本的前处理方式
在测定体液、组织匀浆等生物样品中药物及其代谢物时，首先要将生物样本中的蛋白质除去，使与蛋白质结合的药物释放出来，以便准确地测定药物及其代谢物的浓度。除蛋白的方法有：1）加入与水混溶的有机溶剂及中性盐（如乙醇、甲醇、丙酮和乙腈；硫酸铵、硫酸钠、氯化钠；）；2）加入酸性沉淀剂（如三氯醋酸、高氯酸等）；3）加入重金属离子（如铅、钡、钨酸等）；4）组织的酶消化法（如枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等）。
对于与内源性物质缀合的药物同样需先进行缀合物的水解。缀合物水解的方法常用的有：酸水解、酶水解、溶剂解。
经过除蛋白或对缀合物进行水解后的生物样本，需进行进一步的提取净化才能进行分析测试，通常可采用液?液萃取或液?固萃取法进行纯化。
以上是我们对生物样本采集后到检测前在保存过程中应注意的几个方面的一些看法，希望对进行此方面研究的人员有所帮助。
作者：cde
第二篇：稳定性考察方案
文 件 内 容
1．目 的
2．责任人
3．适用范围
4. 内 容
1．目的
建立稳定性考察方案，对产品品种、批号、有效期进行考察，为产品制定有效期提供依据。
2．责任人
留样观察管理员
3．适用范围
已经生产的全部产品。
4. 内 容
1.稳定性考察方法：长期试验
长期试验是在接近药品实际贮存条件下进行，其目的是为制订药品的有效期提供依据。供试品要求3批，市售包装，在温度25℃±4℃，相对湿度60%±15%的条件下放置36个月，分别于第0月、3月、6月、9月、12月、24月、36月，按稳定性考察检查项目进行检查，将结果与0月比较观察其质量否有显著性差异。
2检测时间的规定
2.1取样检查时间：6个月允许±15天；12个月后允许±30天。
2.2样品取出先放在常温下，一般要求一周内完成检测；温湿度敏感的药品要及时检测。
3.稳定性试验方案的实施
3.1在药品稳定性试验前，留样管理员应检查其储存条件是否合格。检查合格后将样品存入指定位置。
3.2留样管理员依据稳定性试验方案确定的考察品种、考察月份、检查项目，及时取样、申请检验。
3.3稳定性考察检查项目：
其中，性状，主要检查中药材或饮片外观颜色是否符合要求，是否有生虫、发霉迹象。
3.4 QC收到请检样品后，依据稳定性考察检查项目，及时安排检测。检测结束后，根据检测结果，出具检验报告书给留样观察员。
3.5稳定性试验结果出现异常情况，调查原因，并将情况及时向质量管理负责人汇报。如果只有一项次要的检测指标有变化（如颜色、水分变化，但仍在标准之内），则继续进行稳定性试验，观察其变化趋势。若发生显著变化，则应调整试验条件，重新进行试验。
3.6稳定性试验中的“显著变化”包括：
3.6.1药品外观、如颜色、水分等超出标准规定。
3.6.2含量超出标准规定。
3.7稳定性试验结束后，留样观察管理员应根据试验数据暂定或确定药品的有效期以及保存条件；并且总结完成稳定性考察报告。