实验总结报告
摘要
1、通过PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳回收得到外源基因parb, 进行BglⅡ和XbaI 双酶切；抽提质粒pIJ86601，进行BamH I和XbaI 双酶切；将两者的酶切产物通过连接转化，培养后抽提质粒进行电泳，测序，检测重组质粒是否构建成功。测序结果显示未构建成功。
2、用相同的方法构建表达载体PGEX-sco3330，由于时间问题尚未完成。
3、诱导蛋白表达，蛋白纯化，蛋白脱盐，bradford法进行蛋白含量测定以及SDS-PAGE电泳和免疫印迹试验（Western Blotting）。
实验内容：
一、 构建质粒pIJ86601-parb
(一) 获取外源基因parb
1. PCR扩增
PCR体系：200?l体系中，高保真pfuDNA聚合酶10X buffer，40 ?l；10mM Mixed dNTP，5 ?l；PrimerA，5 ?l；PrimerB，5 ?l；高保真pfu酶，2 ?l；DMSO，20 ?l；双蒸水，120 ?l；模板 1μl。
PCR程序设定Temp[℃] Time next turns Gradient[℃]
1: 98.0 10min
2: 98.0 30S
3: 60.0 30S 30.0
4: 72.0 30S 2 3 4
5: 72.0 10min
6:16.0 1h
2.
1)
2)
3)
4) 琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的DNA 通过电泳将目的片段与其他DNA尽可能分开,然后用干净的手术刀割下含需回收 DNA的琼脂块,放入1.5ml离心管中。 按每300?l/100mg的比例加入Binding Buffer,置于50-60℃水浴中10分钟,使胶彻底融化。加热融胶时，每2分钟混匀一次。 将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，12,000rpm室温离心2 min。 取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500?l Wash Solution,12,000 rpm室温离心30秒。
5)
6)
7)
8) 取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500?l Wash Solution, 12,000 rpm，静止放置一分钟，室温离心30秒。 取下UNIQ-10柱,倒废液, 将柱放回同一收集管，12,000 rpm室温离心2min。 将柱放在一新的EP管中, 在柱子膜中央加30?l水，室温或37℃放置2分钟。 12,000 rpm室温离心2分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，
可立即使用或保存于-20℃备用。
(二) 抽提质粒pij86601（OMEGA Plasmid Mini Kit）
1. 挑取适量含质粒pij86601的菌株接种于5ml 加有阿伯拉抗生素的LB液体培养基中， 37℃培养12-16小时。
2. 取1.5~5.0 ml 的菌液，于室温下10,000 x g 离心1min 以沉淀菌种。
3. 倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250μl SolutionⅠ/RNaseA 混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。
4. 往重悬混和液中加入250 μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7-10 次。
5. 往上述混和液中加入350μl solution III，并温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。
6. 室温下，≥12000 x g 离心10min。
7. 将液转移到放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，,12,000rpm室温离心30秒。
8. 取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500?l DNA Wash Buffer,12，000 rpm室温离心15秒。
9. 取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500?l DNA Wash Buffer, 12,000 rpm，静止放置一分钟，室温离心15秒。
10. 取下UNIQ-10柱,倒废液, 将柱放回同一收集管，12,000 rpm室温离心2分钟。
11. 将柱放在一新的EP管中, 在柱子膜中央加30?l Elution Buffer或水(PH>7.0)，室温或42℃放置2分钟。
12. 12,000 rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为提取的载体质粒，可立即使用或保存于-20℃备用。
(三) 外源基因与载体连接
1. 对目的基因parb进行BglⅡ和XbaI 双酶切，37℃ 60分钟。 酶切体系
（100μl）：
10 x Buffer 10μl，BglⅡ 1μl，XbaI 1μl，加ddH2O至100μl。酶切后电泳回收。
2. 对载体pij86601进行BamH I和XbaI 双酶切，37℃ 60分钟。酶切体系
（100μl）：
10 x Buffer 10μl，BamH I 1μl，XbaI 1μl，加ddH2O至100μl。酶切后电泳回收。
3. 用T4 ligase 对酶切后的目的基因和载体进行16℃连接过夜，连接体系
（10μl）：10X Buffer 1μl， T4 ligase 1μl, 目的基因 7μl， pIJ86601 1μl。
(四) 重组DNA 导入宿主菌及检测
1. Kcm法转化
1) 在EP管中加入80μlddH2O,20μl 5*kcm,1μl连接产物，混匀后加入到
100μl DH5α感受态中，冰浴30min。
2) 转入42℃水浴热激90s。
3) 再置于冰水浴1-2min。
4) 加入800μL培养基后，37℃保温45-50min。
5) 将转化菌液涂于含终浓度为100μg/mL阿伯拉霉素的BL平板上。
6) 培养后挑单克隆涂于新的含抗阿伯拉霉素的BL平板上。
2. 快抽质粒：
在转化后，挑单克隆菌可进行快抽质粒检测是否连进外源。
1)
2)
3)
4)
5) 加含有溴酚蓝的Solution I 30?l。 加Solution II 15?l，75℃加热15分钟。 加酸酚10?l，震荡。 12000r,3min 离心。 取上层进行凝胶电泳。
3. 普通抽提质粒（OMEGA Plasmid Mini Kit）
1) 选取质粒大小正确的单克隆菌，接种于5ml加有抗生素的LB液体培
养基，37℃培养12-16小时。
2) 取1.5~5.0 ml 的菌液，于室温下10,000 x g 离心1min 以沉淀菌种。
3) 倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250μl SolutionⅠ/RNaseA 混
和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。
4) 往重悬混和液中加入250 μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7-10 次。
5) 往上述混和液中加入350μl solution III，并温和地上下颠倒离心管数
次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。
6) 室温下，≥12000 x g 离心10min。
7) 将液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，,12,000rpm室温
离心30秒。
8) 取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500?l DNA
Wash Buffer,12，000 rpm室温离心15秒。
9) 取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500?l DNA
Wash Buffer, 12,000 rpm，静止放置一分钟，室温离心15秒。
10) 取下UNIQ-10柱,倒废液, 将柱放回同一收集管，12,000 rpm室温离
心2分钟。
11) 将柱放在一新的EP管中, 在柱子膜中央加30?l Elution Buffer或水
(PH>7.0)，室温或50℃放置2分钟。
12) 12,000 rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的质粒，可立
即使用或保存于-20℃备用。
4. 质粒交由伯尚公司测序验证表达载体构建是否成功。
二、 构建表达载体PGEX-sco3330
(一) 获取外源基因sco3330
1. PCR扩增
PCR体系：200?l体系中，FastpfuDNA聚合酶10X buffer，40 ?l；10mM Mixed dNTP，5 ?l；sco3330-E-F2，5 ?l；Sco3330-K-R，5 ?l；Fastpfu酶，2 ?l；DMSO，20 ?l；双蒸水，120 ?l；模板 1μl。
PCR程序设定Temp[℃] Time next turns Gradient[℃]
1: 98.0 10min
2: 98.0 30S
3: 58.0 30S 30.0
4: 65.0 30S 2 3 4
5: 65.0 10min
6:16.0 1h
2. 琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的DNA
1) 通过电泳将目的片段与其他DNA尽可能分开,然后用干净的手术刀割下
含需回收 DNA的琼脂块,放入1.5ml离心管中.
2) 按每300?l/100mg的比例加入Binding Buffer,置于50-60℃水浴中10分
钟,使胶彻底融化。加热融胶时，每2分钟混匀一次。
3) 将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，12,000rpm
室温离心2 min。
4) 取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500?l Wash
Solution,12,000 rpm室温离心30秒。
5) 取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500?l Wash
Solution, 12,000 rpm，静止放置一分钟，室温离心30秒。
6) 取下UNIQ-10柱,倒废液, 将柱放回同一收集管，12,000 rpm室温离心
2min。
7) 将柱放在一新的EP管中, 在柱子膜中央加30?l水，室温或37℃放置2
分钟。
8) 12,000 rpm室温离心2分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，
可立即使用或保存于-20℃备用。
(二) 抽提质粒PGEX（OMEGA Plasmid Mini Kit）
a) 挑取适量含质粒PGEX的菌株接种于5ml 加有氨苄抗生素的LB液体培
养基中， 37℃培养12-16小时。
b) 取1.5~5.0 ml 的菌液，于室温下10,000 x g 离心1min 以沉淀菌种。 c) 倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250μl SolutionⅠ/RNaseA 混和
液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。
d) 往重悬混和液中加入250 μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7-10 次。
e) 往上述混和液中加入350μl solution III，并温和地上下颠倒离心管数次混
匀，直至形成白色絮狀沉淀。
f) 室温下，≥12000 x g 离心10min。
g) 将液转移到放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，,12,000rpm室温离心30
秒。
h) 取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500?l DNA Wash
Buffer,12，000 rpm室温离心15秒。
i) 取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500?l DNA Wash
Buffer, 12,000 rpm，静止放置一分钟，室温离心15秒。
j) 取下UNIQ-10柱,倒废液, 将柱放回同一收集管，12,000 rpm室温离心2
分钟。
k) 将柱放在一新的EP管中, 在柱子膜中央加30?l Elution Buffer或水
(PH>7.0)，室温或42℃放置2分钟。
l) 12,000 rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为提取的载体质粒，可
立即使用或保存于-20℃备用。
(三) 外源基因与载体连接
1. 对目的基因sco3330和载体PGEX进行EcorI和XhoI 双酶切，加入XhoI
2h 后再加入EcorI，置于37℃ 60分钟。对载体PGEX 进行去磷化处
理。酶切体系（100μl）：10 x Buffer 10μl，EcorI 1μl，XhoI 1μl，加ddH2O至100μl。酶切后电泳回收。
2. 用T4 ligase 对酶切后的目的基因和载体进行16℃连接过夜，连接体系
（10μl）：10X Buffer 1μl， T4 ligase 1μl, 目的基因 7μl，PGEX 1μl。
(四) 重组DNA 导入宿主菌及检测
1. Kcm法转化
1) 在EP管中加入80μlddH2O,20μl 5*kcm,1μl连接产物，混匀后加入到100μl
DH5α感受态中，冰浴30min。
2) 转入42℃水浴热激90s。
3) 再置于冰水浴1-2min。
4) 加入800μL培养基后，37℃保温45-50min。
5) 将转化菌液涂于含终浓度为100μg/mL氨苄抗生素的BL平板上。
6) 培养后挑单克隆涂于新的含抗氨苄抗生素的BL平板上。
2. 快抽质粒：
在转化后，挑单克隆菌可进行快抽质粒检测是否连进外源。
1) 加含有溴酚蓝的Solution I 30?l。
2) 加Solution II 15?l，75℃加热15分钟。
3) 加酸酚10?l，震荡。
4) 12000r,3min 离心。
5) 取上层进行凝胶电泳。
3. 普通抽提质粒（OMEGA Plasmid Mini Kit）
1) 选取质粒大小正确的单克隆菌，接种于5ml加有抗生素的LB液体培养
基，37℃培养12-16小时。
2) 取1.5~5.0 ml 的菌液，于室温下10,000 x g 离心1min 以沉淀菌种。
3) 倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250μl SolutionⅠ/RNaseA 混和
液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。
4) 往重悬混和液中加入250 μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7-10 次。
5) 往上述混和液中加入350μl solution III，并温和地上下颠倒离心管数次混
匀，直至形成白色絮狀沉淀。
6) 室温下，≥12000 x g 离心10min。
7) 将液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，,12,000rpm室温离心
30秒。
8) 取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500?l DNA Wash
Buffer,12，000 rpm室温离心15秒。
9) 取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500?l DNA Wash
Buffer, 12,000 rpm，静止放置一分钟，室温离心15秒。
10) 取下UNIQ-10柱,倒废液, 将柱放回同一收集管，12,000 rpm室温离心2
分钟。
11) 将柱放在一新的EP管中, 在柱子膜中央加30?l Elution Buffer或水
(PH>7.0)，室温或50℃放置2分钟。
12) 12,000 rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的质粒，可立即
使用或保存于-20℃备用。
4. 质粒交由伯尚公司测序验证表达载体构建是否成功。
三、 蛋白表达、纯化及浓度测定
(一) 蛋白表达
1. 挑取阳性单克隆于5ml有氨苄抗生素抗性LB培养基中， 37℃震荡培养过
夜，抽质粒转化到BL21感受态中，将转化菌液涂于加有氨苄抗生素的BL平板中过夜培养。再按1%的量接种到250 ml氨苄抗生素LB培养基，37℃震荡培养4小时，使菌体生长到OD值0.4。
2. 加入1/1000IPTG诱导蛋白表达，16℃低温震荡12小时。
3. 诱导培养后，培养液冰浴30分钟，取菌液于大离心管中，4℃ 4000r 离
心10min，弃上清，加入30ml细胞裂解液悬浮菌体，4℃ 4000r 离心10min，弃上清，再用30ml细胞裂解液悬浮菌体，加入40μl的蛋白酶抑制剂PMSF，置于冰盒中，超声破碎99个循环。
4. 将破碎后的细胞裂解液收集入离心管，4℃ 13000r 离心40min，取上清，
存放于4℃。
(二) 蛋白纯化
1. 将Ni-NTA柱料混匀后，吸取1ml装入纯化柱，用10ml双蒸水洗柱料2次，
再用细胞裂解液平衡柱料2次。
2. 将平衡后的柱料与超声破碎后的细胞液混合加入Corning管，用混合器
4℃结合2小时。
3. 将结合好的柱料加入纯化柱，用洗杂液I洗柱2次，用洗杂液II洗柱2次，
加入3ml的洗脱液，静置10分钟，收集纯化蛋白液。
(三) 蛋白脱盐
1. 透析袋的制备
1) 把透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段。
2) 在大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋
煮沸10分钟。
3) 用蒸馏水彻底清洗透析袋。
4) 放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。
5) 冷却后，存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取
用透析袋是必须戴手套。
6) 用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。
2. 透析脱盐
用镊子取出透析袋，用双蒸水清洗一次，再用透析液清洗一次，加入蛋白液，夹紧夹子后，放入透析液，用磁力搅拌器4℃搅拌30分钟，换透析液；换液3次后，收集蛋白，并分装，存放于-70℃。
(四) 蛋白质含量测定
采用bradford法对蛋白进行含量测定。取900μl bradford工作液于EP管中，加入一定量的待测蛋白，混匀后用ddH2O补至1000μl。设定空白对照，用NanoDrop ND2000C超微量分光光度计进行测定。
(五) SDS-PAGE电泳
1. 根据所要分离蛋白质分子量的大小，配制适当浓度的SDS-PAGE胶，常
用浓度为12％。将收集的不同蛋白样品（或细胞裂解液）置于凝胶加样缓冲液中，在100 ℃加热10分钟以使蛋白质变性；设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样，需要时加入Protein Marker；电泳装置与电源连接好，电流应流向阳极，先将电压调至80 V电泳20min，待溴酚蓝迁移到浓缩胶与分离胶界面处，改用100V电压电泳约1 h，待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5 cm处，关闭电源；
2. 用考马斯亮蓝染色1小时，回收染色剂。
3. 用脱色液脱色3次，每次30分钟。
4. 用双蒸水洗净后，拍照。
(六) 免疫印迹试验（Western Blotting）
1. SDS-PAGE电泳。
从电泳装置上卸下SDS-PAGE凝胶玻璃板，用去离子水冲洗干净，准备进行免疫印迹操作。
2. 转膜
在容器中加入转膜缓冲液，将2块海绵、硝酸纤维素膜（NC膜）和4张普通滤纸浸泡约10min（若用PVDF膜，则首先要将PVDF膜置于甲醇中浸透10min，然后和硝酸纤维素膜同样使用）；从黑色面开始依次将海绵、滤纸、SDS-PAGE胶、膜、张滤纸、海绵叠放在一起，成三明治状，注意对齐并赶出其中的气泡；将膜靠近阳极装入转膜电泳槽中(胶在阴极，对于黑色面)；接通电源，在冰浴中进行转膜，恒流300毫安（或恒压100伏）转膜1 h，或恒压30V转膜过夜。
3. 封闭和杂抗
以下各步均置于摇床上进行：
将转好的膜浸于5％脱脂牛奶（用1×TBST配置，4 ℃保存一周内使用）中，在4 ℃封闭60min；将膜浸于含有一抗（根据需要1：1000-1：3000稀释）的5％脱脂牛奶中室温1-2 h或者 4 ℃过夜；用1×TBST将膜浸洗3次，10min/次；将膜浸于含有二抗（根据需要1：3000-1：10000稀释）的5％脱脂牛奶中室温60min；用1×TBST将膜浸洗3次，10min/次，膜即可用于显色反应。（注：若使用偶联酶标抗体，则在牛奶封闭后, 将膜浸于含有抗体的1×TBST 中1 h，然后用1×TBST 将膜浸洗3 次，10min/次，膜即可用于显色反应。）
4. 显色
目前主要使用底物化学发光ECL-PLUS试剂盒进行显色：将膜表面的液体略微沥干；以40：1的比例混匀Solution A：Solution B（通常用量为400 μl/膜），混匀后均匀覆盖于膜的表面，避光放置3-5min；将膜表面的液体略微沥干后，用Typhoon扫描显影；如需要固定于暗盒中压X光片时，用干净的保鲜膜包裹膜，不要有皱纹，压片时间可适当调节；显影，定影，分析结果。
实验结果与分析：
基因测序结果表明pIJ86601-parB 重组质粒未构建成功。
可能的原因有：
1、BglⅡ和XbaI 的酶切Buffer 选用NEB Cutsmart，影响了BglⅡ的活性，因为BglⅡ在 NEB Cutsmart 中的活性仅为10%。综合考虑两种酶，应该选用NEB3 Buffer，BglⅡ在其中的活性为100%，
XbaI 在其中的活性为75%也基本能满足要求。
2、载体酶切后未进行去磷处理，可能产生自连，影响外源跟载体的连接效率。
3、感受态保存时间过长，可能影响转化效率。
致谢
在中科院植生所实习的近一个月时间里，得益于各位师兄师姐的帮助，让我对实验室工作有了更多的了解，实验技能得到了一定提高，特别是对分子生物学相关的理论知识和实验技能方面有了更多的了解。
同时，也非常感谢赵老师和王老师在生活上对我的关心和学习上对我的指导。
感谢你们让我有了一段充实而愉快的实习经历！