实验：细胞培养

　　1.实验目的

　　初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。

　　2.实验原理

　　从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。

　　细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

　　细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。

　　3.实验用品

　　3.1 材料和标本 乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)

　　3.2 器材和仪器 手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。

　　2.3 试剂 含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。

　　4.实验方法

　　4.1 原代细胞培养

　　4.1.1 原理

　　细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。

　　4.1.2 操作

　　①．取材

　　用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。

　　②．切割

　　用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

　　③．消化、接种培养

　　吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

　　4.1.3 结果

　　细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。

　　4.2 传代细胞培养

　　4.2.1 原理

　　体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。

　　细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。

　　常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

　　4.2.2 操作

　　①．将长成单层的原代培养细胞或HeLa细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟。

　　②.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即

　　在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。

　　③．将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。

　　4.2.3 结果

　　一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。

　　4.3 器材及液体的准备和无菌操作的注意事项

　　4.3.1 器材和液体的准备

　　细胞培养用的玻璃器材，如：培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，120℃，2小时干烤灭菌后备用；手术器材、瓶塞、配制好的PBS液用灭菌锅15磅，20分钟蒸气灭菌；MEM培养液、小牛血清、消化液用G6滤器负压抽滤后备用。

　　4.3.2 无菌操作中的注意事项

　　在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。

　　5．实验报告

　　(1).原代细胞和传代细胞培养有哪些区别?

　　(2).总结一下你自己的经验，怎样才能既迅速，又保证无菌操作。

第二篇：原代细胞培养

原代细胞培养实验

实验目的和要求：

掌握无菌操作技术。

了解小鼠解剖操作技术。

了解原代细胞培养的一般方法与步骤

了解培养细胞的消化分散。

了解细胞计数方法。

了解倒置显微镜的使用。

实验原理：

原代细胞培养

是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。

实验内容：

动物的选择：

选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。

每组小鼠胚胎1个

实验材料：

每组的超净台中有以下物品：

1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶

2. 100ml灭菌烧杯2个；

3、50ml离心筒2个

4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个

4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个

5、细胞计数板1块；

6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；

7、酒精灯1台；

试验操作步骤：

1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)

  a．采用认可的方案处死啮齿动物。   

  b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。

  c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。

  d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。

  e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。

  f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎，  用PBS漂洗。

3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。

4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分钟。

5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。

6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。

7)离心混合的细胞悬液，1200r/rain，5分钟，弃上清。

8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。

9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。

10)用含有10％牛血清和抗生素(如青霉素、链霉素)的DMEM(GIBCO／BRL)lOml再悬沉淀，并使终体积为20ml。

11)让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。

12)为确定现有细胞浓度，加入0.2ml细胞悬液于1.8ml 1％醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。

13)按每细胞瓶I x 106细胞的数量接种于10ml组织培养液中，在饱和湿度的37°C CO2培养箱中孵育直至细胞铺满。