1 引言

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色^[1]。本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。

2 材料和方法

2.1  实验原理

2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理

2.1.1.1 性能

聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。

2.1.1.2 制备原理

聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。电极缓冲液的pH = 8.3，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配胶的缓冲液用Tris、SDS和HCl配制。

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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

实验原理：

SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

试剂和器材：

试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。

2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。

5. TEMED（四乙基乙二胺）原液

6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）

7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

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一、原理 细菌体中含有大量蛋白质,具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用,通过加热使蛋白质解离,大量的SDS结合蛋白质,使其带相同密度的负电荷,在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上,不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色,可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量,可筛选阳性表达的重组体。二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr)29.0g,亚甲双丙烯酰胺(Bis)1.0g,混匀后加ddH2O,37OC溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。3、1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。5、10?电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g,甘氨酸 18.8 g,10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。6、10%过硫酸铵(AP)： 1gAP加ddH2O至10ml。7、2?SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml,b-巯基乙醇1.0ml,SDS 0.6 g,甘油 2.0ml,0.1%溴酚兰 1.0ml,ddH2O 3.5ml。8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g,甲醇225ml,冰醋酸 46ml,ddH2O 225ml。9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置(一)聚丙烯酰胺凝胶的配制1、 分离胶(10%)的配制: ddH2O 4.0ml 30%储备胶 3.3ml 1.5M Tris-HCl 2.5ml 10% SDS 0.1ml 10% AP 0.1ml 取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μl封底,余加TEMED 4μl ,混匀后灌入玻璃板间,以水封顶,注意使液面平。(凝胶完全聚合需30-60min)2、 积层胶(4%)的配制： ddH2O 1.4 ml 30%储备胶 0.33 ml 1M Tris-HCl 0.25 ml 10%SDS 0.02 ml 10%AP 0.02 ml TEMED 2 μl 将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间,完全聚合需15-30min。(二)样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液,100℃加热3-5min,离心12000g×1min,取上清作SDS-PAGE分析,同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。(三)上样: 取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。(三) 电泳:在电泳槽中加入1?电泳缓冲液,连接电源,负极在上,正极在下,电泳时,积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止(约需3hr)。(四) 染色:将胶从玻璃板中取出,考马斯亮兰染色液染色,室温4-6hr。(五) 脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。(六) 凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像,结果存于软盘中,凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。三、注意事项1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。2、为达到较好的凝胶聚合效果,缓冲液的pH值要准确,10%AP在一周内使用。室温较低时,TEMED的量可加倍。3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性,可通过皮肤和呼吸道吸收,应注意防护。

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实验二十五  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

测定蛋白质相对分子质量

一、目的要求

1、掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的原理。

2、巩固垂直板电泳的基本操作。

3、学会用该方法测定蛋白质的相对分子量。

二、原理

    聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。1967年，Shapiro等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate，SDS)后，与SDS结合的蛋白质带有一致的负电荷，电泳时其迁移速率主要取决于它的Mr(相对分子质量)，而与所带电荷和形状无关。

    当蛋白质的Mr在15000～200000之间时，蛋白质的Mr与电泳迁移率间的关系可用下式表示：

lgMr=K-bm

图1 37种蛋白质的Mr对数与电泳相对迁移率关系图

Mr范围为11000～70000，

10％凝胶， pH=7.2, SDS-磷酸盐缓冲系统

式中，Mr为蛋白质的相对分子质量；m为迁移率；b为斜率；K为截距。均为常数。在条件一定时，b和K将已知相对分子质量的标准蛋白质的迁移率对Mr的对数作图，可得到一条标准曲线(如图1)。将未知相对分子质量的蛋白质样品，在相同的条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率可在标准曲线上查得它的相对分子质量。

SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的非共价键 (氢键、疏水键)打开，并结合到蛋白质分子上(在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4 g SDS／g蛋白质)，形成蛋白质—SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。

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实验五  聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析

小麦幼苗过氧化物酶同工酶 

生物111班    杨明轩    1102040128

一、研究背景及目的

过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 - 1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。

而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。

要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。基于 “差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。

同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。

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实验十一    聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

一、     目的

1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术；

2、掌握同工酶遗传标记的分析方法。

二、     原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide  gel  electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝胶为作为支持介质的一种常见电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合法以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速器。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

由于同工酶的酶蛋白分子的大小和结构不同，携带的电荷种类和数量不同，所以可用凝胶电泳将它们一一分开。在适宜酶催化反映的条件下提供酶作用的底物，再利用特殊的显色反应以显示产物的形成或底物的消失，就可以看到经电泳分离后的同工酶谱带。同工酶的鉴定过程通常如下：

1、从植物样品中提取粗酶液；

2、聚丙烯酰胺凝胶电泳把样品中酶带分开；

  用专一作用底物和特殊染料把需要分析的酶染色，显示同工酶谱。

同工酶技术是通过电泳和组织化学方法进行特异性染色而把酶蛋白分子分离，并将其位置和活性直接在染色区带以酶谱的形式标记出来。分离同工酶的方法有：电泳法、层析法、酶学法和免疫学其中以电泳法最为普遍，电泳法中又以垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率为最好。聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种物理效应：1、样品的浓缩效应；2、凝胶的分子筛效应；3、一般的电泳分离的电荷效应。

三、     仪器、设备、药品及材料

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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

实验原理：

SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

试剂和器材：

试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇[a1] ，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。

2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。

5. TEMED（四乙基乙二胺）原液

6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）

7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

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