1、简述PCR的基本原理：依据体内细胞分裂中DNA半保留复制机制，以及在体外DNA分子于不同温度下双链和单链可互变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使DNA变性成为单链DNA，后者再与引物结合退火及在dNTP存在下，DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA

2、试比较PCR与生物体内DNA复制的区别：（列表）①反应部位：DNA体外合成放大过程/生物体内DNA合成②引物：DNA引物作为新链的一部分/RNA引物在复制终止时切除③催化剂：Taq DNA聚合酶，有5＇-3＇核酸外切酶功能，无3＇-5＇核酸外切酶功能，DNA聚合酶，有5＇-3＇和3＇-5＇和萨外切酶功能④基本过程：变性、退火、延伸的循环/复制起始、延伸和终止⑤反应实质：扩增靶DNA/合成子代DNA，将亲代DNA遗传信息传递给子代

3、PCR技术的特点：①高度敏感性②高度特异性③操作简便、快速④适用样品的广泛性

4、引物设计的基本要求：①引物长度要适合②G+C的含量一般为40%~60%③四种碱基应随即分布，不要有连续三个以上的相同嘌呤或嘧啶存在④引物内不存在互补序列⑤两个引物间不应互补，尤其是它们的3＇端不应互补⑥引物与非特异靶区之间是同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源⑦引物3＇端是引物延伸始点，因此不能错配⑧引物5＇端可以修饰⑨引物扩增跨度适合

5、PCR试验中注意事项: ①隔离不同操作区②采用一次性吸头③样品制备应严格按照无菌操作原则进行④设置严格对照，以提高PCR结果的准确性

6、循环次数是否越多越好？为什么？不是。因为过多的循环次数会增加非特异性产物及碱基错配数，并且PCR反应后期会出现平台反应，引物浓度降低，合成产物量下降

7、简述PCR反应体系中Taq酶的特点、性质及作用：⑴特点：①良好的热稳定性②Mg2＋依赖性③忠实性，有5＇-3＇外切酶活性，无3＇-5＇外切酶活性，无校正功能④最适温度为70~75℃⑤具有反转录活性⑵性质：Taq酶活性需要Mg2＋浓度变化既不能过低也不能过高。若过低时，酶活性显著降低；若过高时，酶活性会受到抑制同时还会催化非特异性扩增。⑶作用：以DNA为模板，从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种dNTP以碱基互补配对方式，按引物5＇-3＇方向合成新的DNA链

8、PCR技术的主要用途：基因诊断、基因治疗、基因工程产品、法医学检测、人类学研究、目的基因的克隆、筛选目的基因、直接测序、DNA和RNA的微量分析、标记DNA探针、寻找新基因、检测环境中的致病菌。

9、转基因动物基本原理及步骤：⑴通过人工操作的方式，将外源基因整合到动物的基因组中，并使受体动物能稳定地将次基因遗传给后代的实验技术称为装基因动物技术。⑵步骤：①外源目的基因的获得和载体的构建②将外源目的基因有效地导入生殖细胞或胚胎干细胞，选择获得转基因阳性细胞③选择合适的体外培养系统和宿主动物，使转基因胚胎发育④鉴定、筛选所得到的基因动物品系

10、转基因的基本方法有哪些？①显微注射法②胚胎干细胞法③逆转录病毒感染法④精子载体法⑤体细胞核转移法

11、外源基因导入植物的方法有哪些？⑴间接转化法：①农杆菌介导法②病毒介导法⑵直接转化法：①化学物质诱导法②电传孔法③脂质体法④微注射法⑤基因枪法⑥离子束介导法⑦花粉管通道法

12、ASO法的中文名称和原理：⑴中文名称：等位基因特异寡核苷酸探针杂交法⑵原理：根据已知正常基因的核苷酸序列和致病基因突变点的核苷酸序列，人工合成两者寡核苷酸探针，一种探针M能与突变基因碱基序列特异互补结合，另一种探针N能与正常基因碱基序列特异互补结合，用它们分别于吸附在固相支持物上的受检者DNA进行分子杂交。若受检者DNA能与M杂交，而不与N杂交，说明受检者是这种突变的杂合子；若受检者DNA不

能与M结合，但能与N结合，说明受检者不存在这种突变基因；若受检者DNA和M、N均不结合，证明其缺陷基因可能是一种新的突变类型。所以，寡核苷酸探针杂交法不仅可以确定已知突变，还为发现新的突变基因提供了有效途径。

13、SSCP法的中文名称和原理：⑴中文名称：单链构象多态性⑵原理：首先用PCR扩增DNA突变区域，将扩展产物变性成单链，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，单链正常基因与单链异常基因由于迁移速度不同而分离，借此可分析确定致病基因的存在。

14、限制性内切酶酶谱分析法的原理：①当基因突变发生在限制性内切酶位点序列中而导致该酶切位点消失②原本没有酶切位点的序列因突变而获得酶切位点，用相应的限制性内切酶酶切后，其特异的限制性酶切片段的大小和多少会发生改变，通过凝胶电泳分离DNA片段，再转移DNA至硝酸纤维素膜，最后用特异性探针杂交显示出来，借此可作出分析诊断

15、基因增补的策略和常用方法（导入正常基因、导入免疫基因、导入耐药基因、导入活化药物前体酶类基因、导入基因疫苗）的原理：基因增补是将目的的基因导入病变细胞或其他细胞，不去除异常基因，导入的目的基因可非定点整合，也可不整合，通过导入基因表达产物补偿缺血基因的功能或使原有的功能得以加强。若用正常基因弥补缺陷基因功能，属于异位替代；若原有基因正常，通过增加外来同源的正常基因，以加强原有的功能，属于基因补充；若导入外源基因是使细胞获得新的生物学特性，属于基因修饰。/导入正常基因（异位替代）、导入免疫基因（基因补充）、导入耐药基因（基因修饰）、导入活化药物前体酶类基因（基因修饰）、导入基因疫苗（基因修饰）。

16、基因失活的策略和常用方法（反义RNA技术、核酶技术、三链技术、干扰RNA技术）的原理：基因失活也称基因干预，是将特定的核酸序列导入靶细胞后，在转录或翻译水平阻断相应基因的异常表达，或破坏mRNA的结构，以达到治疗疾病的目的。反义RNA技术、核酶技术是特异性封闭细胞内现存基因，使其不能作为模板来表达产物；三链技术、干扰RNA技术是特异性破坏细胞内现存基因。

17、RELP连锁分析的原理：若致病基因与同一条染色体上的某一RFLP存在连锁关系，则可从RFLP家谱分析中间接推知致病基因的存在

18、用逆转录病毒载体进行基因治疗有何优点和局限性？⑴优点：①转染率高②目的基因表达率高且持久③载体提取和扩增简便④宿主范围广⑵缺点：①容量偏小②宿主范围窄③诱发致癌性的可能④不排除产生野生型病毒的可能⑤只能感染分裂期细胞，宿主细胞的选择一般局限于分裂旺盛的细胞

19、腺病毒载体的构建和扩增：首先构建含有目的基因的质粒；其次，用限制性酶切割野生型Ad5DNA，获得复制缺陷型的Ad5；然后将质粒切成线性，与缺陷型Ad5共转染人胚肾细胞系293细胞，经同源重组后形成的重组后病毒DNA，此重组病毒具有转录和复制的能力，同时也携带有目的基因

20、基因诊断的特点：①针对性和特异性②具有很高的灵敏度③能获得稳定的结果④属于快速的早期诊断技术⑤应用范围广，适用性强

21、如何获得目的基因：①用化学合成法：即用DNA合成仪人工合成目的基因②用PCR或RT-PCR法合成：从组织或细胞中获取目的基因③从基因文库中筛选：包括基因组DNA库和cDNA文库

22、筛选与鉴定重组DNA分子的方法有哪些？⑴根据重组载体的遗传表现进行筛选：①根据载体的抗药性标记筛选②根据载体的抗药性标记插入失活选择③根据β-半乳糖苷酶显色反应筛选④根据插入的外源基因形状进行筛选⑵限制性核算内切酶鉴定⑶核酸分子杂交⑷PCR法⑸免疫化学检测法

23、试述兰-白斑筛选的原理：pUC系列载体以及其他一些载体中含有LacZ＇基因中含有MCS,当外源DNA片段插入MCS后，LacZ＇α-肽基因的读码框被破坏，不能产生完整的

有活性的β-半乳糖苷酶。这样转入重组DNA分子的菌落在含有IPTG/X-gal的培养基上显白色；而没有外源片段插入的载体转化的细菌，在含有IPTG/X-gal的培养基上显蓝色。

24、载体是什么？作为载体需要具备什么条件？载体是能携带外源DNA分子进入受体细胞进行扩增和表达的运载用具。应具备条件：①具有自主复制能力②有多个单一限制性内切酶的酶切位点③具有两个以上的选择性遗传标记④分子量小⑤拷贝数高⑥具有较高的遗传稳定性

25、何为DNA重组技术？试述DNA重组技术的基本过程？⑴DNA重组技术是在体外将不同来源的特异基因或DNA判断插入病毒，质粒或其他载体分子，然后将重组DNA导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增，提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。⑵基本过程：①分离目的基因②用限制性内切酶③让分子接合重组④转入细胞⑤筛选出重组体

26、DNA重组技术重要的工具酶有哪些？简述其功能：⑴限制性核算内切酶：识别DNA特定序列，切断DNA链⑵DNA聚合酶Ⅰ或其大片段：①缺口平移制作标记DNA探针②合成cDNA的第二链③填补双链DNA3＇凹端④DNA序列分析⑶DNA连接酶：连接两个DNA分子或片段⑷多核苷酸激酶：催化多核苷酸5＇羟基末端磷酸化，制备末端标记探针⑸末端转移酶：在3＇末端加入同质多聚物尾⑹DNA端酶Ⅰ：降解DNA，在双链DNA上产生随机切口⑺核酸外切酶：是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来⑻核酸内切酶：是从核酸链中间水解3＇，5＇磷酸二酯键，将核酸链切断⑼DNA限制性内切酶：粘性末端配对重组⑽同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。其产生同样的切割，形成同样的末端。⑾同尾酶：这一类的限制酶来源各异，识别的靶子序列也不相同，但产生相同的粘性末端，由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的

27、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性是什么？其切割双链DNA产生哪几种不同的切口？⑴基本特性：①大部分Ⅱ型限制酶能够识别由4个~8个核苷酸组成的特定序列，这样的序列即为限制性核酸内切酶的识别序列②Ⅱ型酶识别具有回文结构的核苷酸序列③Ⅱ型限制酶从其识别序列内切割DNA分子中的磷酸二酯键，产生5＇-P、3＇-OH的DNA片段，识别序列又被称为其切割位点或靶序列④不同的限制性内切酶不仅识别的核苷酸序列不同，而且切割DNA后产生的片段末端也不相同⑵切口：①3＇-OH粘端切口②5＇-P粘端切口③平端切口和钝切口

28、DNA重组技术的本质及连接方式：⑴本质：DNA重组技术又称分子克隆，DNA克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种不同来源的DNA与载体DNA连接成具有自我复制能力的DNA分子，进而通过体外转化、转染或感染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子，再进行扩增、提取获得同一的DNA分子，即DNA克隆，又称基因克隆⑵连接方式：①粘性末端连接：目的基因与载体分子经同一限制性核酸内切酶切割成具有相同粘性末端的DNA片段后，可通过粘性互补配对，再借助DNA连接酶封闭缺口，形成完整的重组DNA分子②平末端连接：某些限制性核酸内切酶对DNA分子切出平齐的末端，可利用T4 DNA连接酶将两者连接③人工接头连接：指在要连接的外源基因或载体DNA两端，先接上一段人工合成的DNA片段，这个接头就是限制性核酸内切酶的识别位点。借此可再用一种或两种限制性核酸内切酶将其切开，产生粘性末端，将外源基因与载体DNA连接④同聚物加尾连接：如果待连接的两个DNA片段均为平末端，或者两个DNA片段的连接段不是互补的粘性末端，可通过同聚物加尾法在其末端引入互补粘性末端，即利用末端转移酶把互补的多聚核苷酸连接到两个DNA片段的末端，然后用DNA连接酶将其连接。

29、影响核酸杂交的因素：①探针的浓度：双链探针浓度大，DNA-RNA杂交受影响，单链探针浓度大，核酸杂交率一般增加②碱基组成：C-G含量多，杂交率增加③温度：0℃杂交非常缓慢，低于Tm值20~25℃杂交率最大，温度Tm-5时，杂交率十分低下④离子强度：

强度高，杂交率增加；强度低，杂交率低⑤杂交分子的大小：杂交分子小的易杂交，杂交分子大的难杂交

30、影响Tm值的因素：①DNA碱基组成：C-G含量越多，Tm值越高；A-T含量越多，Tm值越低②溶液的离子强度：在低离子强度中，Tm较低，而且解链的温度范围较宽；在高离子强度中，Tm值较高，解链的温度范围较窄③PH值：溶液的PH值在5~9范围内，Tm值变化不明显，当PH>11或PH<4时，Tm值变化明显④变性剂：各种变性剂主要是干扰碱基堆积力和氢键的形成而降低Tm值

31、缺口平移法,与随机引物法，标记探针的基本原理如何? ⑴缺口平移法：微量的DNA酶Ⅰ在Mg2＋存在下，可在双链DNA上随机打开若干个单链切口产生3＇-OH端大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，具有5ˊ-3＇聚合酶活性，以相对应的链为模板，从3＇-OH端逐个加入新的核苷酸，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ具有5＇-3＇外切核酸酶活性，可从切口的5＇端逐个切去核苷酸，因此，3＇-OH端核苷酸将置换原有飞核苷酸制备出DNA探针⑵随机引物法：DNA聚合酶利用寡核苷酸作引物，沿单链模板开始DNA的合成。由于寡核苷酸链很短，且序列不均一，可在模板许多位置上与之杂交，故产生许多起始点不同的拷贝。先将DNA变性，然后用大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段进行合成。该酶具有5＇-3＇DNA聚合酶活性，很弱的3＇-5＇外切核酸酶活性，而无5＇-3＇外切核酸酶活性。因此，发射性标记产物全部是通过引物延伸而不是切口平移所合成的，并且不会被核酸外切酶降解，结合在模板上的寡核苷酸也不会被降解，有利于合成随机起始。

32、光敏生物素标记核酸探针的机理如何？光敏生物素标记核酸是一类由对光敏感物和生物素结合的标记物。光敏生物素在组成上的共同点是一端为光敏基团，另一端是生物素，两者间由一个碳原子数目不等的连接臂相连接。连接臂的作用是降低生物素基团对核酸杂交的空间位阻，光敏基团的作用是在光照下与碱基较交联反应，而生物素则为检测时的标记物。如光生物素的光敏基团芳香叠氮基团，它在可见光下，其叠氮基团转变成活性芳香烯基，后者能与DNA和RNA的碱基发生交联反应。

33、设计寡核苷酸的探针的基本原则及优点如何？⑴原则：①探针长度一般要在10~50bp②G-C含量为40%~60%③探针分子内部无互补序列，即不应有>4bp的碱基反向互补碱基对，否则其内部会形成发夹结构④避免同一碱基重复出现，一般不能多于4个⑵优点：①可根据需要合成相应序列，避免天然探针中存在的高度重复序列带来的不良影响②大多数寡核苷酸探针链短与等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短③寡核苷酸探针长度只有10~50bp，能明显降低杂交Tm值④可大量合成，价格低，能用酶学或化学方法进行非放射性标记

34、非放射性探针检测的体系与原理如何？⑴非放射性探针的标记物不同其显色体系和方法也不同。除酶直接标记的探针外，其他非放射性标记探针的显示需进行二步法：第一步是探针与检测体系进行偶联反应，生成一个能与显色体系作用的中间物质；第二步中间物质再与显色系统反应，显色后才可检测杂交结果。⑵检测体系：①碱性磷酸酶显色体系②辣根过氧化物酶显色体系③亲合素—生物素—酶 复合物显色体系

35、核酸杂交基本原理：利用变性作用将DNA双链分开加入不同来源的DNA单链或RNA链，经过退火处理，不同来源的两条多核苷酸链依靠碱基互补关系形成杂种双螺旋

36、ASO法的中文名称及原理：⑴ASO中文名称为等位基因特异寡核苷酸探针杂交法⑵原理是根据已知正常基因的核苷酸序列和致癌基因突变位的基因序列，人工合成两种寡核苷酸探针，一种探针M能与突变基因碱基序列特异互补结合，另一种探针N能与正常基因碱基序列特异互补结合，它们分别吸附于固相支持物上的.

第二篇：分子生物学总结

09生物类专业分子生物学复习大纲

第一章 绪论

1、早期主要由哪些实验证实DNA是遗传物质？这这些实验的主要论点证据？

答：㈠美国微生物学家Avery先将光滑型致病菌灭活后侵染小鼠，小鼠未死亡；再用活的粗糙型细菌侵染小鼠，小鼠未死亡；用灭活的光滑型致病菌和或的粗糙型细菌混合侵染小鼠，小鼠死亡，且在小鼠体内发现了大量的光滑型细菌。说明DNA是遗传载体。

㈡美国科学家Hershey用被标记的细菌感染没有放射性标记的细菌，经过1-2个噬菌体DNA复制周期后发现，自带噬菌体中几乎不含带标记的蛋白质，但含有带标记的核酸，说明DNA是遗传物质。

2、阐述分子生物学的主要研究内容？

答：分子生物学是研究核酸蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其功能、规律性和相互关系的科学。研究目的是在分子水平上阐明细胞活动的规律，揭示生命的本质。主要内容有四个方面：①DNA重组技术②基因表达调控研究③生物大分子的结构功能研究④基因组、功能基因组与生物信息学研究。

第二章 染色体与DNA复制

1、简述真核生物染色体的组成及组装过程？

答：①组成: 由许多核苷酸连接而成的生物大分子，而每个核苷酸又由磷酸、核糖和碱基3个部分组成。

1.蛋白质：蛋白质包括组蛋白和非组蛋白，组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。 ②组装过程: （1）在核小体中DNA盘绕组蛋白八聚体核心，从而使DNA分子压缩至原尺寸的1/7。

（2）1/7的压缩比仍远远低于染色体中DNA的压缩比. （1）10nm纤维是由核小体串联成的染色质细丝，其在低离子强度及无H1条件下产生。（2）30nm纤维—在离子强度较高且有H1存在时，由10nm 的染色质细丝盘绕成螺旋管状的粗丝（螺线管）。螺线管的每一螺旋含有6个核小体，所以其压缩为6倍；（3）经螺线管可进一步压缩成超螺旋：一个细长、中空的圆筒，直径为4000nm，由30nm螺线管缠绕而成，压缩比是40。（4）超螺旋圆筒进一步压缩5倍成为染色体单体。

2、原核生物DNA具有哪些不同于真核生物DNA的特征？

答：原核生物：a、基因组小,b、结构简练, c、存在含多顺反子的转录单元,d、基因存在重叠现象。 真核生物:a、基因组大,b、基因组存在大量重复序列（基因外区域）,c、真核生物基因组的大部分为非编码序列（90%）,d、真核生物基因组的转录产物为单顺反子,e、真核基因是断裂基因，即含有内含子结构,f、真核基因组存在大量的DNA多态性,g、真核基因组具有端粒结构（5~15kb）,

3、简述原核生物DNA的复制特点？

答：原核生物E. coli DNA复制的特点：基因组DNA是双链环状；复制起始区位于其遗传图的84min附近；OriC含有3个13bp和4个9bp的两个保守序列。复制起始后形成的两个复制叉沿着整个基因组双向等速移动，DNA复制中间产物呈一个θ。

真核生物DNA复制的特点：（1）DNA分子上出现多复制起始位点；（2）真核生物染色体在全部完成复制前，各个起始点上DNA复制不能再开（3）真核生物DNA复制只在其细胞周期S期进行；（4）真核生物复制子大小约为40~100kb。

4、解释在DNA复制过程中，后随链是怎样合成？

答：后随链在合成过程中，一段亲本ＤＮＡ单链首先暴露出来，然后以与复制叉移动相反的方向、按照５＇→３＇方向合成一系列的冈崎片段，然后再把它们连接成完整的后随链。

第三章 生物信息的传递（上）—从DNA到RNA

1、简述RNA转录的概念及其基本过程？

转录：从DNA到RNA的过程，基因表达的核心步骤。

基本过程

一、模板的识别 RNA聚合酶与转录起始区上游的启动子双链DNA相互作用，与之相结合

二、转录的起始 RNApoly结合在启动子上以后，使启动子附近的DNA双链解旋并解链，形成转录泡以

促使底物和核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。

三、转录延伸 RNApoly释放σ因子离开启动子后，核心酶沿着模板链移动，并使新生RNA链不断延伸

的过程。

四、转录终止

? 一旦RNA聚合酶开始转录，酶就沿模板向前移动合成RNA，直到遇到终止子序列。

? 终止时：酶停止向正在延伸的RNA链添加核苷酸，开放三元复合物解体。

? 终止可能既需DNA上可识别的终止序列，也需RNA产物的发夹结构。

2、什么是编码链？什么是模板链？

编码链：又叫有意义链，与RNA序列完全相同的那条DNA链

模板链：反义链，据碱基互补原则指导mRNA合成的那条DNA链

3、阐述原核生物mRNA和真核生物mRNA的区别？

1，原核生物mRNA

(1) 许多是以多顺反子形式存在: 起始密码子AUG上游7~12核苷酸处一个SD序列，因为该序列与16S rRNA3?端反向互不，所以被认为在核糖体和mRNA的结合过程中起作用。

(2) 5`端无帽子结构；(3) 3`端没有或只有较短的poly(A)。

2，真核生物mRNA结构特征

(1) 许多是以单顺反子形式(2) 真核生物mRNA的5`端存在“帽子”结构

真核生物的mRNA（不包括叶绿体和线粒体）5?端都是经过修饰的，基因转录一般从A/G起始，第一个核苷酸保留5?端三磷酸基团并能通过3?-OH位与下一个核苷酸的5?磷酸基团形成二酯键转录产物的起始序列为pppApNpNp………。

(3) 真核生物 mRNA 3`端有poly(A) 尾巴，除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3?端都有polyA序列，其长度因mRNA种类不同而变化，一般约为40-200个左右。研究发现：所有真核生物基因的3?转录终止位点上游15-30bp处的保守序列AAUAAA序列，其对转录初始产物的准确切割及加PolyA是必需的。 生物学功能：

I: 保持mRNA的稳定性，防止被降解；II: 与翻译起始有关。

第四章 生物信息的传递（下）—从mRNA到蛋白质

1、简述遗传密码的特性？P111

（1） 密码的连续性（2） 密码的简并性（3） 密码的通用性和特殊性（4） 密码子与反密码子的相互作用

2、阐述蛋白质的生物合成的基本过程？

（1）氨基酸的活化 蛋白质的生物合成是以氨基酸作为基本建筑材料的，且只有与tRNA相结合的氨基酸才能被准确地运送到核糖体中，参与多肽链的起始或延伸。氨基酸必须在氨酰-tRNA合成酶的作用下生成活化氨基酸—— AA-tRNA。

翻译的起始第一步：30S小亚基首先与翻译起始因子IF-1，IF-3结合，通过SD序列 与mRNA模板结合;

第二步：在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA 上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对;

第三步：带有tRNA，mRNA，三个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。

（2）肽链的延伸 生成起始复合物，第一个氨基酸（fMet/Met-tRNA）与核糖体结合以后，肽链开始伸长。按照mRNA模板密码子的排列，氨基酸通过新生肽键的方式被有序地结合上去。肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位。

（3）肽链的终止 肽链的延伸过程中，当终止密码子UAA、UAG、UGA出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与之结合，而释放因子能识别这些密码子并与之结合，水解P位上多肽链与tRNA

之间的二酯键。接着，新生的肽链和tRNA从核糖体上释放，核糖体大、小亚基解体，蛋白质合成结束。

（4）蛋白质前体的加工 新生的多肽链大多数是没有功能的，必须经过加工修饰才能转变为有活性的蛋白质。包括：N端fMet或Met的切除；二硫键的形成；特定氨基酸的修饰；切除新生肽链中非功能片段 蛋白质合成抑制剂 蛋白质生物合成的抑制剂主要是一些抗生素。如嘌呤霉素、链霉素、四环素、氯霉素、红霉素等，此外，如5-甲基色氨酸、环已亚胺、白喉毒素、蓖麻蛋白和其他核糖体灭活蛋白等都能抑制蛋白质的合成。

3、氨酰-tRNA在蛋白生物合成过程中的作用？

蛋白质的生物合成是以氨基酸作为基本建筑材料的，且只有与tRNA相结合的氨基酸才能被准确地运送到核糖体中，参与多肽链的起始或延伸。氨基酸必须在氨酰-tRNA合成酶的作用下生成活化氨基酸—— AA-tRNA。

4、比较原核生物与真核生物核糖体的组分？

原核生物 2/3的RNA及1/3的蛋白质

真核生物 RNA占3/5,蛋白质占2/5

5、阐述蛋白质信号肽的概念及其功能？

信号肽长度为13-36aa左右，其具有以下三个特点：

（1）一般带有10-15个疏水氨基酸；（2）在靠近该序列N-端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（丙氨酸或甘氨酸）。

第五章 分子生物学研究方法

1、简述PCR技术扩增DNA片段或基因的原理和过程？

PCR的定义：在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。

原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

过程：模板DNA变性：加热至94℃左右，双链DNA解离成单链；

模板DNA与引物的退火(复性)：55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

引物的延伸：在Taq DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链；

重复循环变性--退火--延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。

2、简述DNA重组技术的概念和原理？

用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等，是基因工程技术的核心。

重组DNA技术一般包括四步：①获得目的基因；②与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；③用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④对转化子筛选和鉴定。在具体工作中选择哪条技术路线；⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。主要取决于基因的来源、基因本身的性质和该项遗传工程的目的。

3、阐述基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别？

基因组文库特点： 由于基因组文库来自于某一物种的基因组，而该物种所有组织中的基因组均相同，所以基因组文库具有种属特异性，无组织特异性。

cDNA文库—cDNA文库来自于某一物种某种组织的mRNA，所以cDNA文库既有种属特异性，也有组织特异性。

cDNA文库的构建

由于cDNA的长度一般在0.5~8kb，常用的质粒载体和噬菌体载体都能满足要求。

cDNA文库载体选择要根据该文库的用途来确定。例如：

Uni-zapXR载体是一种λ噬菌体载体，具有噬菌体的高效性和质粒载体系统可利用蓝白色筛选的便利，可容纳10kb DNA插入片段，重组载体通过体内剪切反应（in vivo excision）将cDNA插入片段转移到质粒系统中，克隆和序列分析。

4、阐述用蓝白斑筛选法筛选重组体的原理？

生物科学蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

5、用那些主要技术和方法研究蛋白质组学？

蛋白质组学是蛋白质和基因组研究在形式上和内容两方面的完美组合，该技术致力于研究某一物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、时间所表达的全部蛋白质图谱

（1）双向电泳技术：是分离大量混合蛋白质组份的最有效方法。该方法依赖于蛋白质的两个特性，等电点和相对分子质量。蛋白质是两性分子，在不同PH的缓冲液中表现出不同的带电性，不同等电点的蛋白质会聚集在介质上不同的区域而被分离。蛋白质的相对分子质量决定了SDS-蛋白复合物在凝胶电泳中的迁移率。蛋白质在SDS凝胶电场中的运动速度和距离完全取决于其相对分子质量而不受其所带电荷的影响。

（2）蛋白质印迹法：用来检测样品中是否存在蛋白质抗原。原理是根据被测蛋白质能与特异性抗体结合的特性和该蛋白的相对分子质量。该法具有高效、简便、灵敏等特性。

步骤：A蛋白样品的制备；B经过SDS-PAGE分离样品；C分离的蛋白转移到膜载体上，转以后首先将膜上未反应的位点封闭起来以一直抗体的非特异性吸附；D用固定在膜上的蛋白质做抗原，与对应的非标记性抗体（一抗）结合；E洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性同位素标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分。

（3）蛋白质的质谱分析技术：用生物质谱鉴定电泳分离后的蛋白质。可将现行的质谱仪简单的分为三个连续的组成部分：离子源、离子分离区、检测器。

第六章 原核生物基因表达与调控

1、什么是操纵子学说？

操纵子学说是关于原核生物基因结构及其表达调控的学说，由法国巴斯德研究所著名科学家雅各布(F. Jacob)和莫诺(J.Monod)于19xx年提出的，并在xx年内经过许多科学家的补充和修正得以逐步完善。如大肠杆菌乳糖操纵子调控模型，色氨酸操纵子调控模型

2、简述（lac）乳糖操纵子的调控模型？

大肠杆菌乳糖操纵子是大肠杆菌DNA的一个特定区段，由调节基因I，启动基因P，操纵基因O和结构基因Z、Y、A组成。Z编码β-半乳糖苷酶；Y编码β-半乳糖苷透过酶；A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶。 P区是转录起始时RNA聚合酶的结合部位。 O区是阻遏蛋白的结合部位, 其功能是控制结构基因的转录。I基因经常进行转录和翻译，产生有活性的阻遏蛋白。

① Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码。

② 这个mRNA分子的启动子紧接着O区，而位于I与O之间的启动子区(P), 不能单独起动合成β-半乳糖苷酶和透过酶的高效表达。

③ 操纵区（O）是DNA上的一小段序列(仅为26bp), 是阻遏物的结合位点。

④当阻遏物与操纵基因结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制。

⑤诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lac mRNA的合成。

3、简述（lac）乳糖操纵子的本底水平表达？

在非诱导状态下有少量的lac mRNA的合成，大约每个世代有1~5个mRNA分子，这种合成被称为本底水平的永久型合成。这是由于阻遏物的结合并不是绝对紧密的，即使在它与操纵基因紧密结合时，也会偶尔掉下来，这时启动子的障碍被解除，RNA聚合酶开始转录。这种现象以每个细胞周期1～2次的概率发生。

4、简述（trp）色氨酸操纵子的调控模型？

trp操纵子是由一个启动子和一个操纵基因区组成，该操纵基因区控制一个编码色氨酸生物合成需要的5种蛋白的多顺反子mRNA的表达

色氨酸操纵子的调控包括阻遏系统和弱化系统

trp操纵子的阻遏系统

当培养基中色氨酸含量较高时，它与游离阻遏蛋白相结合，并使之与操纵区DNA紧密结合并关闭trp mRNA的转录；当色氨酸含量低时，阻遏蛋白失去色氨酸并其从操纵子解离，trp操纵子开启。

trp操纵子的弱化系统

L区编码了前导肽，当有高浓度Trp存在时，由于弱化子a的作用，转录迅速减弱停止，生成140核苷酸的前导RNA；当Trp浓度较低时，弱化子不起作用，转录得以正常进行，生成长约7kb的mRNA，操纵子中第一个结构基因的起始密码子AUG在+162处。

5、简述弱化子与前导肽对trp操纵子的调控作用？

4、阐述正调控和负调控的主要不同是什么？